宋 奇 程安源 徐 立 余 鈴 夏 平

Anti-osteosarcomaEffectofGarcinolbyMediatingJAK2/STAT3SignalingPathway.SongQi,ChengAnyuan,XuLi,etal.DepartmentofOrthopedics,WuhanFirstPeople′sHospital,Hubei430022,China

AbstractObjectiveTo study the effect of garcinol on cell viability, cell cycle distribution, apoptosis of osteosarcoma cells and the growth of subcutaneous tumor in nude mice and further explore its mechanism.MethodsU2OS cells were treated with vary concentrations of garcinol. The cell viability of osteosarcoma cells were detected by CCK-8 assay.The cell cycle distribution and apoptosis rate of U2OS cells were determined by flow cytometry. The subcutaneous osteosarcoma model of nude mice was constructed to detect the effect of garcinol intraperitoneal injection on the growth of subcutaneous tumor of nude mice. RNA-Sequence analysis was used to detected genes influenced by garcinol treatment. The expression levels of proteins in JAK2/STAT3 signal pathway were detected by Western blot.ResultsCCK-8 assay showed that garcinol reduces cell viability of U2OS cells in a concentration- and time-dependent manner. The results of flow cytometry suggested that garcinol treatment could arrest cell cycle at S phase and induce apoptosis of osteosarcoma cells. Furthermore, garcinol inhibited the growth of subcutaneous tumor in nude mice. Gene-Set Enrichment Analysis showed that JAK/STAT signaling pathway was significant enriched in garcinol treated osteosarcoma cells. The expression levels of p-JAK2, p-STAT3, Bcl-xl were significantly decreased and the expression level of Bax were significantly increased in osteosarcoma cells and osteosarcoma tumor tissues treated with garcinol.ConclusionGarcinol exerts anti-osteosarcoma effect in vitro and in vivo, which may be related to the down-regulation of JAK2/STAT3 signaling pathway.

KeywordsGarcinol; Osteosarcoma cells; Cell viability; JAK2/STAT3 signaling pathway

骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是人體骨骼系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，常見于長(zhǎng)管狀骨干骺端，惡性程度高，預(yù)后較差[1]。骨肉瘤患者的治療手段，早期主要包括外科截肢手術(shù)治療、放療及化療等，患者5年生存率不足10%。近年來(lái)隨著對(duì)腫瘤病因、病理及藥理等研究的深入，以及新輔助化療方案的出現(xiàn)，患者的5年生存率明顯提高，但仍無(wú)法與乳腺癌等腫瘤相比[2]。由于順鉑、阿霉素等常用的化療藥物的毒性作用及長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致化療耐藥的出現(xiàn)，限制了臨床上化療藥物選擇、影響治療的效果[3]。因此，亟需尋找新的低毒、高效的抗腫瘤藥物，而國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的研究者開始從祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)里面尋找抗腫瘤新藥[4]。

山竹醇(garcinol)是從印度藤黃的干果皮中提取出來(lái)的黃色結(jié)晶化合物，其主要成分為多聚異戊二烯基苯甲酮，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性，也可作為低分子抑制劑抑制組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性[5,6]。既往研究表明，山竹醇對(duì)多種腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生明顯抑制作用，包括口腔鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌等，這些研究雖證明山竹醇具有抗多種腫瘤細(xì)胞活性，但是未能深入探究山竹醇抗癌機(jī)制，并且山竹醇在骨肉瘤中的作用及機(jī)制目前還未見報(bào)道[7～9]。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究山竹醇抗骨肉瘤作用，并借助RNA-Seq測(cè)序手段初步探究其抗骨肉瘤作用的相關(guān)機(jī)制，以期為山竹醇后續(xù)進(jìn)行化療藥物增敏實(shí)驗(yàn)及用于臨床上骨肉瘤患者的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料：人骨肉瘤U2OS細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。α-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。1%雙抗(青霉素100U/ml, 鏈霉素100μg/ml)、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、胰蛋白酶購(gòu)自武漢谷歌生物科技公司；DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，山竹醇購(gòu)自美國(guó)Glpbio公司；CCK-8(Cell Counting Kit-8)購(gòu)自上海陶素生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；抗GAPDH、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT、Bax和Bcl-xl一抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤U2OS細(xì)胞培養(yǎng)在含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并調(diào)整培養(yǎng)溫度為37℃，給予含有10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基，隔天換1次液，后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和裸鼠皮下種植實(shí)驗(yàn)均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行。

3.細(xì)胞活力檢測(cè)：將細(xì)胞消化重懸后，調(diào)整骨肉瘤U2OS細(xì)胞密度為5×105/ml，取100μl接種于96孔板上，孵育8h待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的山竹醇(0、1、3、10、30、100μmol/L)，分別培養(yǎng)24h和48h，PBS洗1次后，每孔加入100μl CCK-8試劑和培養(yǎng)基的混合液(1∶9)，37℃避光孵育1h，使用多功能酶標(biāo)儀并調(diào)整波長(zhǎng)為450nm，測(cè)量每孔細(xì)胞的吸光度值(A)。細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值×100%。

4.細(xì)胞周期檢測(cè)：用不同濃度山竹醇(0、3、10、30μmol/L)處理骨肉瘤U2OS細(xì)胞24h后，用冷PBS洗滌2次，收集細(xì)胞后用75%乙醇固定過夜，離心后用PBS洗滌1次，加入200μl冷PBS重懸細(xì)胞，再加入2μl RNA酶A(1mg/ml)和50μl PI(50μg/ml)，室溫下置于暗盒中孵育30min，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。

5.細(xì)胞凋亡分析：不同濃度山竹醇(0、3、10、30μmol/L)處理骨肉瘤U2OS細(xì)胞24h后，離心收集細(xì)胞，取200μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入Annexin Ⅴ/FITC和PI熒光染料，各5μl，后樣品置于暗盒中室溫下孵育20min，然后再加入300μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

6.Western blot法檢測(cè)：不同濃度山竹醇(0、3、10、30μmol/L)處理骨肉瘤U2OS細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液冰水裂解30min，4℃、12000r/min離心后取上清，提取總蛋白蛋白，蛋白定量后取10μg總蛋白，進(jìn)行10%或12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳條件為100V、120min，電泳完成后進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為200mA、90min，轉(zhuǎn)膜完成后用5%脫脂奶粉于室溫封閉1h，TBST洗滌3次，每次10min，加入相應(yīng)一抗孵育過夜。TBST溶液振搖洗滌3次，每次10min，按1∶3000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫?fù)u床孵育1h。在暗室中將PVDF膜用底物顯影后曝光分析結(jié)果。蛋白表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/GAPDH的灰度值。

7.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：BALB/c-nu裸鼠購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，18只裸鼠隨機(jī)分為3組，通過打耳標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，飼養(yǎng)1周待小鼠狀態(tài)恢復(fù)后，于右側(cè)背部皮下接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U2OS骨肉瘤細(xì)胞，每只裸鼠接種細(xì)胞量約為5×106個(gè)。每3天監(jiān)測(cè)小鼠生長(zhǎng)情況及成瘤情況，接種1周后開始隔天腹腔注射山竹醇，分為高劑量組(2mg/kg)和低劑量組(1mg/kg)[7]。對(duì)照組注射相同體積的DMSO，每3天測(cè)量1次皮下瘤的長(zhǎng)徑和短徑。接種4周后，裸鼠全身麻醉后通過頸椎脫位法處死，取出瘤體組織，-80℃冰箱保存。皮下瘤體積(mm3)=(長(zhǎng)徑×短徑2/2)。

8.RNA-Seq測(cè)序分析：將山竹醇(10μmol/L)處理24h后U2OS骨肉瘤細(xì)胞樣本與對(duì)照組樣本收集后，提取總RNA，每組重復(fù)3次，-80℃保存，由武漢谷歌生物科技公司完成RNA-Seq測(cè)序。取處理組和對(duì)照組中基因改變|log2(Fold Change)|>2的基因?yàn)椴町惢颍褂肎SEA4.0.3軟件進(jìn)行基因富集分析。

結(jié) 果

1.山竹醇對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞活力的影響：用不同濃度的山竹醇處理骨肉瘤細(xì)胞24h或48h后，采用CCK-8法檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞活力。隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)或藥物濃度的增加，與空白對(duì)照組(0μmol/L山竹醇)比較，山竹醇處理組中，U2OS細(xì)胞活力逐漸降低(圖1)。

2.山竹醇對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞周期分布的影響：采用PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度山竹醇處理后細(xì)胞周期分布的變化。骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度山竹醇(0、3、10、30μmol/L)處理后，處于S期的細(xì)胞顯著增加，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖1 山竹醇對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞活力的抑制作用與0μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 山竹醇對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞周期分布的影響A.對(duì)照組(0μmol/L山竹醇處理組)；B.3μmol/L山竹醇處理組；C.10μmol/L山竹醇處理組；D.30μmol/L山竹醇處理組；E.細(xì)胞周期定量分析。與0μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01

3.山竹醇對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡的影響：使用不同濃度山竹醇(0、3、10、30μmol/L)處理骨肉瘤細(xì)胞24h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞凋亡率。隨著山竹醇藥物濃度的增加，U2OS細(xì)胞凋亡率也顯著提高(圖3)。

4.山竹醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響：將山竹醇(10μmol/L)處理24h后U2OS骨肉瘤細(xì)胞樣本進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序分析。共有2388個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生改變(|log2(fold change)|>2)，其中1351個(gè)基因上調(diào)，1037個(gè)基因下調(diào)。進(jìn)一步通過基因富集分析發(fā)現(xiàn)，山竹醇處理的骨肉瘤細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路顯著富集，并且表現(xiàn)為信號(hào)通路活性降低。進(jìn)一步通過Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3、Bax、Bcl-xl水平，發(fā)現(xiàn)山竹醇處理細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-xl水平明顯降低，而Bax表達(dá)水平顯著升高，并且具有濃度依耐性(圖4)。

5.山竹醇對(duì)裸鼠骨肉瘤生長(zhǎng)的影響：山竹醇能抑制裸鼠皮下骨肉瘤的生長(zhǎng)。檢測(cè)山竹醇處理骨肉瘤組織中p-JAK2、p-STAT3、Bax和Bcl-xl水平，發(fā)現(xiàn)山竹醇處理腫瘤組織中p-JAK2、p-STAT3和Bcl-xl水平明顯降低，而Bax表達(dá)水平顯著升高，并且具有濃度依耐性(圖5)，這一結(jié)果與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

討 論

隨著病理學(xué)、影像學(xué)、藥理學(xué)等多學(xué)科的發(fā)展以及外科手術(shù)的進(jìn)步，目前臨床上對(duì)于早期局限性骨肉瘤患者，經(jīng)過規(guī)范診療后5年生存率可達(dá)70%，然而，對(duì)于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者尚無(wú)切實(shí)有效的治療手段[10，11]。骨肉瘤作為一種間葉組織來(lái)源的惡性腫瘤，對(duì)放療敏感度較差，基于手術(shù)切除和化學(xué)藥物治療的綜合治療手段是骨肉瘤患者的常見治療手段[12]。其中化療藥物對(duì)殺傷腫瘤細(xì)胞、預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)具有重要意義，但對(duì)正常組織細(xì)胞也具有一定的殺傷作用并且長(zhǎng)期使用會(huì)出現(xiàn)藥效的下降[13]。因此尋找高效且低毒的抗腫瘤藥物是當(dāng)前研究的一大方向，越來(lái)越多的學(xué)者將目光投向祖國(guó)傳統(tǒng)中藥。

圖3 山竹醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡率的影響A.對(duì)照組(0μmol/L山竹醇處理組)；B. 3μmol/L山竹醇處理組；C.10μmol/L山竹醇處理組；D.30μmol/L山竹醇處理組;E.細(xì)胞周期定量分析。G1～G4.分別為壞死細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞;與0μmol/L比較，*P<0.01

圖4 山竹醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中p-JAK2、p-STAT3、Bax和Bcl-xl表達(dá)的影響A.基因表達(dá)矩陣火山圖分析；B.基因表達(dá)矩陣GSEA分析；C.JAK/STAT信號(hào)通路基因熱圖分析；D.蛋白電泳結(jié)果；E.蛋白定量分析。與0μmol/L比較，*P<0.05，**P<0.01

圖5 山竹醇對(duì)裸鼠骨肉瘤生長(zhǎng)及腫瘤組織中p-JAK2、p-STAT3、Bax和Bcl-xl表達(dá)的影響*P<0.05，**P<0.01

山竹醇已被證明具有治療各種人類疾病的潛力，如糖尿病、哮喘、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病，而近年來(lái)山竹醇抗腫瘤活性逐漸被證實(shí)。Duan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，山竹醇能抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和侵襲，可能與山竹醇抑制AKT和STAT3的磷酸化、降低MMP2、MMP9的表達(dá)有關(guān)。Zhang等[15]研究證實(shí)，山竹醇能抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，可能與其抑制細(xì)胞線粒體氧化磷酸化，影響細(xì)胞能量代謝有關(guān)。Wang等[16]研究表明，山竹醇能通過降低p300/CBP 和p-Smad2/3水平發(fā)揮抑制食管癌轉(zhuǎn)移的作用。此外，也有學(xué)者證實(shí)，山竹醇也能影響腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性和化療藥物敏感度。Huang等[17]研究表明，山竹醇能通過抑制Wnt/β-catenin/STAT3信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞“干細(xì)胞表型”。Li等[18]通過體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山竹醇能增強(qiáng)頭頸鱗狀細(xì)胞癌對(duì)于順鉑的敏感度。而探討山竹醇在骨肉瘤中的作用的研究目前還不多見，因此，本研究初步探索山竹醇對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞活力、細(xì)胞周期分布和凋亡的影響及對(duì)裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)的影響，并初步探索其相關(guān)作用機(jī)制，以期為后續(xù)進(jìn)行化療藥物增敏實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

本研究用不同濃度的山竹醇(0、1、3、10、30、100μmol/L)處理骨肉瘤U2OS細(xì)胞24h或48h后，CCK-8結(jié)果顯示，山竹醇能時(shí)間、濃度依耐性的抑制骨肉瘤細(xì)胞活力，表明山竹醇具有一定的抗骨肉瘤細(xì)胞作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯是抗腫瘤藥物的重要特征之一，為探究山竹醇對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度山竹醇處理后骨肉瘤細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布的變化，結(jié)果顯示，山竹醇能誘導(dǎo)U2OS細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于S期，這一效應(yīng)具有濃度依耐性。進(jìn)一步驗(yàn)證山竹醇的在體作用，通過皮下種植骨肉瘤細(xì)胞，2周后待皮下成瘤，通過腹腔注射山竹醇，監(jiān)測(cè)皮下腫瘤的生長(zhǎng)，結(jié)果表明，山竹醇能抑制裸鼠皮下骨肉瘤的生長(zhǎng)。

為進(jìn)一步探究山竹醇抗骨肉瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，筆者進(jìn)行了RNA-Seq測(cè)序分析。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，山竹醇處理細(xì)胞中共有2388個(gè)基因表達(dá)水平發(fā)生改變，其中1351個(gè)基因上調(diào)，1037個(gè)基因下調(diào)。進(jìn)一步通過基因富集分析發(fā)現(xiàn)，山竹醇處理的骨肉瘤細(xì)胞細(xì)胞中JAK/STAT信號(hào)通路顯著富集，并且表現(xiàn)為信號(hào)通路活性降低。JAK/STAT信號(hào)通路是由蛋白酪氨酸激酶(JAKs家族)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(STATs家族)組成，目前已發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中JAKs家族共有4種激酶，即JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2，除JAK3外，在JAKs家族蛋白在組織細(xì)胞中廣泛分布。STATs家族作為JAKs的靶蛋白，共有STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6 7種，各種信號(hào)引起受體偶聯(lián)的JAKs家族激酶相互聚集，磷酸化修飾而激活，進(jìn)一步引起下游STATs家族蛋白發(fā)生磷酸化修飾而發(fā)生二聚化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)[19]。有關(guān)JAK2/STAT3信號(hào)通路的研究最為常見，大量研究證實(shí)，JAK2/STAT3信號(hào)通路在腫瘤中高度活化，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程，抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路能通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[20]。

針對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路的靶向治療是目前腫瘤藥物研究中熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，山竹醇處理的骨肉瘤細(xì)胞及腫瘤組織中p-JAK2、p-STAT3和Bcl-xl水平明顯降低，而Bax表達(dá)水平顯著升高，并且具有濃度依耐性。這些結(jié)果表明，山竹醇可能是通過抑制骨肉瘤中JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)性蛋白的表達(dá)從而發(fā)揮抗骨肉瘤作用，此外抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的活性能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，這與以往的研究相符，說明JAK2/STAT3信號(hào)通路可能作為抗骨肉瘤藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)。但本研究尚未探究山竹醇處理細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制的具體機(jī)制，后續(xù)會(huì)進(jìn)一步探討。

綜上所述，山竹醇能在體內(nèi)、體外發(fā)揮一定的抗骨肉瘤作用，可能與其抑制骨肉瘤中JAK2/STAT3信號(hào)通路活性，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)凋亡相關(guān)性蛋白的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。