姚東偉,吳凌云,沈海斌,田守波,李 明

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學院設施園藝研究所,上海市設施園藝技術重點實驗室,上海201403;2上海科立特農(nóng)科(集團)有限公司,上海201106)

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最基本的生產(chǎn)資料,為促進種子發(fā)芽成苗,播種前進行種子處理是生產(chǎn)上的首要環(huán)節(jié)。 顏啟傳等[1]認為種子引發(fā)(Seed priming)最早由Heydecker 等提出。 20 世紀80 年代,鄭光華等[2]率先開展了Seed priming 相關研究,并翻譯為種子引發(fā)。 種子引發(fā)是通過控制種子吸水,使其停留在吸脹第二階段,進行預發(fā)芽生理生化代謝和細胞膜、細胞器修復,然后在胚根伸出前回干。 由于引發(fā)能大大減少種子播種至出苗的時間及胚根伸出時間的一致性,這些優(yōu)勢引起了研究者和生產(chǎn)者的興趣。 20 世紀80年代末,種子引發(fā)技術開始進入了商業(yè)化應用,滾筒引發(fā)、基質(zhì)引發(fā)、膜引發(fā)等專利技術的出現(xiàn),使得種子引發(fā)技術廣泛應用于生產(chǎn)價值高的花卉和蔬菜種子,出現(xiàn)了‘引發(fā)種子’新類型[3]。 種子引發(fā)的成功應用推動了研究者對種子引發(fā)技術及機理的不斷深入研究,近十幾年來,累計超過數(shù)百篇的研究報道及相關專著出版,種子引發(fā)成為種子科學研究領域研究熱點之一[4-6]。

1 種子引發(fā)發(fā)展簡史

播種成苗是關系種植業(yè)生產(chǎn)成敗的首要環(huán)節(jié),為了保證種子正常出苗,種子進行播前處理是必需的。我國在4 300 年前就有了促進種子發(fā)芽的方法,根據(jù)成廣雷[7]報道,在《詩經(jīng)·大雅·生民》篇中載有后稷在播種前進行浸種的內(nèi)容。 此外,曾雄生[8]通過查閱西漢時期的古籍《氾勝之書》,發(fā)現(xiàn)該書中記載了溲種法,溲種法即將獸骨骨汁、繰蛹汁、蠶糞、獸糞、附子、水或雪汁,按一定比例和成稠粥狀淘洗種子,反復多次,最后干燥貯藏再播種,他認為隨后歷史上長期使用的雪水浸種就是秉承了溲種法的遺意,到明清時期,雪水浸種方法大致有三種,一是多次浸種,二是冬浸春播,三是長時間一次浸種。 Paparella 等[4]認為種子引發(fā)技術雛形在16 世紀已出現(xiàn),法國農(nóng)學家Oliver de Serres 記錄了當時農(nóng)民使用糞水浸泡谷物種子2 d 然后陰干的種子播前處理方法,19 世紀,達爾文發(fā)現(xiàn)使用海水浸泡生菜種子可以促進發(fā)芽,隨后,使用營養(yǎng)液浸泡番茄種子可以加快種子發(fā)芽和浸種后合適的干燥時間會導致種子快速發(fā)芽等現(xiàn)象相繼報道。 隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展,生產(chǎn)者對種子播種質(zhì)量的關注日益重視,其中種子活力是表示種子播種品質(zhì)的重要概念,1977 年ISTA 確定種子活力是決定種子或種子批在發(fā)芽和出苗期間的活性水平和行為的那些種子特性的綜合表現(xiàn),高活力種子發(fā)芽及出苗整齊、迅速,對不良環(huán)境抵抗能力強,低活力種子在適宜條件下雖能發(fā)芽,但發(fā)芽緩慢,在不良環(huán)境條件下出苗不整齊,甚至不出苗[9-10]。 隨后十幾年,關于提高種子活力的研究大量報道, 也稱為‘吸濕回干處理’[11-12]、 ‘水合-脫水處理(Hydrationdehydration)’[13]、 ‘種子硬化(Harding)’[14-15]。 1973 年,Heydecker 等用聚乙二醇(PEG)引發(fā)洋蔥種子,促進效果及穩(wěn)定性優(yōu)于當時鹽溶液處理及硬化技術。 從此以后,種子引發(fā)(Seed priming)這一概念逐漸被后續(xù)研究者廣泛采用,引發(fā)作為一種提高種子活力的有效方法,具體的技術不斷被開發(fā)最終實現(xiàn)了商業(yè)化應用。

2 種子引發(fā)技術研究和應用

2.1 引發(fā)技術研究綜述

廣義上的引發(fā)指種子播前為了促進發(fā)芽進行的各種水合處理,隨著研究的不斷深入,各種引發(fā)方法被報道,其共同的基礎是種子水合。 根據(jù)種子吸水方式不同,種子引發(fā)主要可以分為水引發(fā)、滲透引發(fā)、基質(zhì)引發(fā)三大類。 根據(jù)引發(fā)功能拓展不同,又可以分為生物引發(fā)、化學引發(fā)、激素引發(fā)等。

2.1.1 水引發(fā)(Hydropriming)

水引發(fā)直接使用水進行種子處理,生產(chǎn)上使用的浸種處理,將種子直接浸泡在水中一段時間后取出進行播種,也可稱為最古老的一種引發(fā)方法。 水引發(fā)操作簡單,研究者利用此方法在菠菜、西瓜、苜蓿等種子上進行了種子引發(fā)試驗[16-20]。 水引發(fā)的優(yōu)點是僅采用水來處理,不會對環(huán)境造成污染,但存在種子吸水不均勻、吸水量難控制、易造成吸脹損傷等負效應。 Rowse[21]發(fā)明了一種稱為“滾筒引發(fā)”的技術,通過向滾筒內(nèi)噴入水汽,利用計算機系統(tǒng)精確控制種子水分、溫度、水合時間進行引發(fā)處理,成功解決了水引發(fā)的缺點,促進了水引發(fā)的應用。

2.1.2 滲透引發(fā)(Osmopriming)

滲透引發(fā)是一種將種子浸泡到通氣、低水勢溶液中的引發(fā)方法,通過控制滲透質(zhì)溶液的濃度來調(diào)整水的滲透壓,從而控制種子吸水量。 聚乙二醇(PEG)是滲透引發(fā)最廣泛使用的化學物質(zhì),其突出優(yōu)點是它本身不能滲入活細泡,許多學者利用分子量(6 000—20 000)PEG 進行了種子引發(fā)研究,發(fā)現(xiàn)PEG 引發(fā)促進種子發(fā)芽效果明顯[22-23]。 其他化學物質(zhì)如交聯(lián)型丙烯酸納、聚乙烯醇、甘露醇、硝酸鉀、氯化鈉等也可以用于種子引發(fā)。 滲透引發(fā)利用滲透勢控制種子水勢,操作簡單易行,研究和生產(chǎn)上均應用廣泛。

2.1.3 基質(zhì)引發(fā)(Solid matrix Priming)

固體基質(zhì)引發(fā)將種子和基質(zhì)、水按一定比例混合進行種子處理的一種引發(fā)方法。 基質(zhì)引發(fā)中種子通過基質(zhì)吸水,引發(fā)結束后與種子分離,該方法模擬種子在土壤中發(fā)芽,基質(zhì)引發(fā)過程中能夠提供種子代謝所需的氧氣,無需特別的通氣裝置。 常用的固體基質(zhì)有蛭石、沙、珍珠巖等,基質(zhì)引發(fā)方法簡單,成本低,易于操作,應用前景廣泛[24-25]。

2.1.4 生物引發(fā)(Biopriming)

生物引發(fā)是在種子水合過程中添加有益微生物作為種子保護劑的一種引發(fā)方法。 有益微生物微生物可以通過成膜劑包裹到種子上,也可以直接加入到基質(zhì)中。 經(jīng)過生物引發(fā)處理的種子,有益真菌或細菌布滿種子表面,播種后能夠使幼苗免遭有害菌侵襲,同時可以促進作物生長,提高幼苗抗逆性[26-27]。

2.1.5 化學引發(fā)(Chemopriming)

化學引發(fā)是在種子水合過程中加入各種抑菌化學物質(zhì)作為種子保護劑的一種引發(fā)方法。 引發(fā)過程中容易導致微生物積累,在引發(fā)液中加入次氯酸鈉或鹽酸,化學殺菌劑,天然抑菌物質(zhì)可以阻止微生物積累[28-29]。

2.1.6 激素引發(fā)(Hormonal priming)

種子激素引發(fā)是在引發(fā)過程中加入一定濃度的激素達到促進萌發(fā)目的的一種引發(fā)方法。 激素引發(fā)的主要作用是提高幼苗抗逆性、打破休眠等。 目前已有報道的激素種類有赤霉素、脫落酸、油菜素內(nèi)酯、細胞分裂素、丁烯酸內(nèi)酯等[30]。

2.2 種子引發(fā)技術的商業(yè)化應用

隨著引發(fā)技術研究的不斷深入,滾筒引發(fā)、基質(zhì)引發(fā)等專利技術的研發(fā)極大推動了種子引發(fā)技術的商業(yè)化應用。 表1 列出了商業(yè)生產(chǎn)主要采用的幾種引發(fā)技術基本原理,引發(fā)處理通常由專業(yè)化的種子技術處理公司完成,如INCOTEC 種子技術公司、GERMAINS 種子技術公司等,表2 列出了目前提供種子處理服務公司及其產(chǎn)品特點,其中具體實施細節(jié)為商業(yè)機密,但基本原理是一致的。 氣泡柱引發(fā)是常規(guī)的引發(fā)方法,市場可購買到氣泡柱引發(fā)設備(荷蘭種子加工設備有限公司制造),使用者可根據(jù)作物種類自行選擇引發(fā)液完成引發(fā)處理。 由于大量引發(fā)需要保證每粒種子保持一致的水分,滾筒裝置很好的解決了種子水分均勻度和透氣性的問題,處理效果優(yōu)于氣泡柱引發(fā),可以應用到多種引發(fā)技術中。 盡管引發(fā)處理對許多作物種類都有促進發(fā)芽效果,但考慮到處理成本及實際效果等因素,目前生產(chǎn)上應用引發(fā)技術較多的是生菜、甜菜、洋蔥、番茄、草花種子等。 近三十年來,種子引發(fā)技術的應用越來越廣泛,但現(xiàn)有技術主要掌握在幾個專業(yè)種子處理技術公司中,處理成本高、時間長,引發(fā)種子耐貯藏性低制約了引發(fā)技術的進一步發(fā)展。 近年來,瑞典奈爾松種子發(fā)展公司研發(fā)出了“種子活力化技術”,并研發(fā)出活力設備,可以實現(xiàn)種子引發(fā)的自動化處理,該技術具有處理時間短,提高種子耐貯性的優(yōu)點,是引發(fā)技術的重大突破。

表1 種子引發(fā)技術比較Table 1 Comparison of several seed priming technology

表2 商業(yè)上可提供的部分種子引發(fā)處理Table 2 List of some seed priming treatments commercially available

3 引發(fā)效果與機理

引發(fā)可以促進種子萌發(fā)、增強種子不適發(fā)芽條件下的發(fā)芽速度和出苗率、提高老化種子活力、打破種子休眠等[31-32],雖然采用不同的引發(fā)方法會取得不同的引發(fā)效果,歸納起來種子引發(fā)主要有三方面的作用:加速萌發(fā)、提高抗逆性、打破休眠。

3.1 加速種子萌發(fā)

狹義的種子萌發(fā)始于種子吸水(吸脹),終止于胚軸體的伸出,即胚根突破包裹在其周圍的組織(包括胚乳、外胚乳、種皮),具體分為三個階段,階段Ⅰ:吸脹作用和吸脹損傷;階段Ⅱ:遲滯期;階段Ⅲ:萌發(fā)的完成。 種子萌發(fā)的快慢因作物種類而不同,取決于種子自身的性質(zhì)(種皮滲透性、種子大小、可水合的物質(zhì)含量等)和水合期間的環(huán)境條件。 對于同一作物,種子萌發(fā)快慢取決于各個階段的持續(xù)時間,特別是第二階段持續(xù)的時間。 種子引發(fā)期間,通過滲透條件物質(zhì)或限制水分供應對吸水過程進行制約,可以延長階段Ⅱ,同時防止種子進入階段Ⅲ,此時種子保持脫水耐受性,可以進行干燥。 當引發(fā)種子再次吸水時,經(jīng)引發(fā)處理的種子縮短了階段Ⅱ,得以迅速過度到階段Ⅲ并完成萌發(fā)。 通過縮短吸脹階段Ⅱ的時間,迅速從水合階段過渡到胚根突破和生長,引發(fā)處理可以加速萌發(fā)及提高萌發(fā)時間的均一性。

3.1.1 種子引發(fā)中的水分控制

種子引發(fā)技術的基礎是平衡吸脹和水勢之間的關系,利用聚乙二醇或鹽等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(滲透引發(fā))或限制水分供應(基質(zhì)引發(fā)或水引發(fā)),使吸脹種子的水勢下降,種子可以吸水并滿足種子萌發(fā)代謝需求(階段Ⅱ),但胚根伸出受抑制(階段Ⅲ)。 階段Ⅱ持續(xù)時間及階段Ⅲ是否發(fā)生,受溫度和水勢影響,由于吸水初始的水勢梯度非常高,階段Ⅰ受溫度和水勢下降的影響相對較小。 溫度或水勢降低可延長階段Ⅱ的持續(xù)時間,該階段最終含水量由周圍環(huán)境的水勢決定,溫度和水勢的下降也會使呼吸速率減慢,延長階段Ⅱ的持續(xù)時間,水勢低于-1.5—-1.0 MPa,階段Ⅲ則無法進行,存在最低含水量,臨界值因不同物種而異,低于該臨界值胚無法擴展,階段Ⅱ無限延長。 具體的引發(fā)技術通過調(diào)控溫度和水勢,使種子處于階段Ⅱ,進行一系列生理生化變化,包括DNA 和線粒體修復、殘留mRNA 的降解、新蛋白質(zhì)的轉錄和翻譯等[33]。

3.1.2 引發(fā)種子回干

吸脹種子在合適的時間終止引發(fā)并進行合適的回干是種子引發(fā)技術的另一關鍵,水合種子必須在具有脫水耐性前完成干燥,才能保持高活力。 種子在發(fā)育過程中,水分被逐漸積累的貯藏物取代,導致含水量下降,脫水是正常性種子成熟的最終步驟,隨后種子進入代謝靜止階段。 種子具有脫水耐受性是引發(fā)技術應用的基礎,一般種子自然成熟干燥之前就具有脫水耐受性。 Karssen[34]利用藜屬種子進行種子萌發(fā)時間進程研究發(fā)現(xiàn),種子在23 ℃條件下萌發(fā)時,首先是胚根周圍的外種皮裂開(階段1),然后包裹內(nèi)種皮和胚乳層的胚根擴張露出(階段2),最后胚根突破內(nèi)種皮和胚乳層伸出完成萌發(fā)(階段3),整個萌發(fā)進程23 h。 其中階段1 和2 狀態(tài)的種子仍具有耐脫水性,此時種子回干后仍具有正常萌發(fā)能力。 種子萌發(fā)進程一旦進入階段3,則萌發(fā)已完成,種子回干后便喪失發(fā)芽能力。

3.1.3 種子引發(fā)加速萌發(fā)的機理

關于種子促進萌發(fā)的機理已有多方面的研究報道,但尚無全面公認的解釋。 目前研究主要包括引發(fā)誘導細胞膜修復、使RNA 和蛋白質(zhì)合成增加等,可總結為蛋白表達、能量代謝及細胞分裂三個方面。

3.1.3.1 引發(fā)促進蛋白表達

干燥種子處于代謝靜止和生長停滯的狀態(tài),其代謝恢復需要大量的生化變化由酶及其他功能蛋白催化。 RNA 和蛋白質(zhì)的從頭合成是種子萌發(fā)的重要過程。 Gallardo 等[35]通過甘藍和擬南芥種子轉錄組學和蛋白組學的研究表明萌發(fā)和引發(fā)實際上是相似的過程,種子萌發(fā)期間表達的多數(shù)基因蛋白在引發(fā)過程中同樣表達。 Chen 等[36-37]利用-0.6 MPa PEG 在15 ℃下引發(fā)菠菜種子,發(fā)現(xiàn)引發(fā)過程中蛋白表達譜與種子正常發(fā)芽過程中蛋白表達譜相似,引發(fā)種子回干后引發(fā)過程中上調(diào)表達的Ⅱ型蛋白消失,但當種子再次水合時,與未引發(fā)種子相比,引發(fā)種子更早更多的積累Ⅱ型蛋白,說明干燥處理并不能消除種子引發(fā)過程中曾上調(diào)表達Ⅱ型蛋白的“記憶”。

3.1.3.2 引發(fā)增強能量代謝

引發(fā)種子活力高,快速萌發(fā)需要更多的能量,線粒體是產(chǎn)生ATP 的重要細胞器,種子吸脹開始后,原有線粒體功能完善及數(shù)目增加,效率逐漸增加。 盡管線粒體部分受到HSPs 和LEAs 蛋白的保護,但在種子成熟階段和發(fā)芽初期仍然會出現(xiàn)損傷[38]。 因此,在干燥和新鮮吸脹種子中,線粒體均有部分缺陷,需要在吸脹早期進行進一步修復[39]。 吸脹種子中存在兩種不同類型的線粒體發(fā)育模式,一種是修復和激活成熟干燥種子中已存在的細胞器,另一種是合成新的線粒體。 引發(fā)可以促進線粒體發(fā)育,誘導產(chǎn)生這兩種類型的線粒體。 Sun 等[40]發(fā)現(xiàn)大豆引發(fā)種子線粒體的內(nèi)膜和外膜比未引發(fā)種子的線粒體膜具有更大的完整性。 Bray 等[41]發(fā)現(xiàn)滲透引發(fā)處理的洋蔥種子胚包含更多數(shù)量的線粒體。 種子引發(fā)處理中延長了萌發(fā)第二階段時間,在這個階段促進了線粒體的發(fā)育,引發(fā)種子擁有一個更大的能量庫和更有效的ATP 生產(chǎn)系統(tǒng),可以為引發(fā)后的再次萌發(fā)提供更好的硬件保障。 目前,關于種子引發(fā)過程中主要代謝途徑的路徑研究還很有限,引發(fā)過程中線粒體蛋白組和轉錄組的研究將有助于闡釋引發(fā)過程中的主要代謝途徑。

3.1.3.3 引發(fā)促進細胞分裂和細胞擴大

胚從外周組織中伸出是萌發(fā)完成的標志,胚根伸出必須物理性地突破胚乳和種皮等包圍在外周的組織。 因此,胚產(chǎn)生的膨脹力與外周組織的物理限制之間的平衡,決定了萌發(fā)是否完成及完成的時間。 阻礙胚根生長的外力由外周組織如胚乳和外種皮產(chǎn)生,軟化胚乳,特別是靠近胚根尖端的珠孔端胚乳,是決定胚根伸出的一項重要因素[42-43]。 Nakaune 等[44]研究發(fā)現(xiàn)NaCl 引發(fā)促進編碼膨脹素、β-甘露聚糖內(nèi)切酶、木葡萄糖內(nèi)糖基轉移酶等削弱胚乳阻力相關基因的蛋白上調(diào)表達。 萌發(fā)完成不需要細胞有絲分裂,但胚性組織的細胞膨大是胚根突破種皮的另一項重要因素。 成熟干燥胚的細胞一般處于G1或G0期(2C的DNA),隨著萌發(fā)進行,胚細胞開始進入G2期(4C 的DNA),但不發(fā)生分裂。 種子萌發(fā)時存在兩個DNA合成階段:一是干燥種子吸脹后與DNA 的修復相關,二是為萌發(fā)后的細胞分裂做準備。 DNA 復制的時間可以反映種子活力,低活力的種子為確保成功復制,需要更長時間來完成初始DNA 修復。 DNA 核酸復制活動的強弱可以用4CDNA(G2階段)和2CDNA(G0∕G1階段)的比率高低表示。 引發(fā)促進了DNA 的修復和復制,引發(fā)種子常常比未引發(fā)種子含有較高的4C∕2C DNA 比率。 引發(fā)種子發(fā)芽迅速,高4C∕2C DNA 比率可以作為提早發(fā)芽狀態(tài)的生物標記。 然而,并非每種引發(fā)方法均能提高4C∕2C DNA 比率,這與引發(fā)條件和最初的種子批質(zhì)量有關[45]。

3.2 種子引發(fā)提高抗逆性

引發(fā)可以提高種子抗逆性,當?shù)蜏鼗蚱渌{迫延遲種子萌發(fā)時,引發(fā)對種子萌發(fā)速率和均一性的提高更加明顯。 Bruce 等[46]認為引發(fā)可以當做是種子預發(fā)芽脅迫,種子回干后存在“脅迫記憶”,從而誘導交叉耐性,使得引發(fā)種子再次發(fā)芽時提高抗逆性。 此類現(xiàn)象已有較多研究報道,例如,過氧化氫預處理誘導小麥幼苗耐鹽性[47],水引發(fā)、氯化鈣引發(fā)、ABA 引發(fā)誘導(Brassica juncea)耐鹽性和耐旱性[48]。

3.2.1 植株引發(fā)和種子引發(fā)

植株引發(fā)(Plant priming)是指植株在遭受生物脅迫后能夠誘導植株產(chǎn)生更多的抵抗力而應對隨之即來的生物或非生物脅迫,使用非生物脅迫誘導植株抗性的過程,也被稱為植株適應環(huán)境。 盡管種子引發(fā)和植株引發(fā)均能提高脅迫抗性,但二者并不相同,種子引發(fā)是一個不完全萌發(fā)過程,期間適度的非生物脅迫被用來阻止胚根伸出,因此這種概念上的差異導致兩種類型的引發(fā)所產(chǎn)生抗性具有不同的細胞機制。植株引發(fā)通過蛋白質(zhì)、轉錄因子和表觀遺傳改變等誘導抗性記憶。 在種子引發(fā)中,脅迫抗性的評價是通過在逆境環(huán)境下種子發(fā)芽表現(xiàn),如在脅迫下發(fā)芽引發(fā)種子胚根比未引發(fā)種子更早更多突破種皮來體現(xiàn)[46]。 目前關于植物交叉耐性現(xiàn)象的機制有三種解釋:①專業(yè)蛋白誘導;②抗氧化途徑的活性;③較低相對分子質(zhì)量化合物的積累[49]。 關于種子引發(fā)提高交叉耐性機制仍處于研究中。

3.2.2 種子引發(fā)過程中的脅迫

種子引發(fā)和種子正常發(fā)芽過程的關鍵差別在于引發(fā)控制種子吸水、限制吸脹種子胚根伸出,引發(fā)處理本身可以看做是干旱脅迫。 PEG 是引發(fā)處理中常用的一種滲透引發(fā)劑,也常被用作滲透脅迫的誘導劑,會給細胞造成氧化傷害[50]。 H2O2-引發(fā)中種子直接遭受氧化脅迫。 ABA 激素引發(fā)中通過ABA 信號傳導直接刺激脅迫反應。 回干過程可能是引發(fā)種子遭受的另一種脅迫,引發(fā)中種子部分水合由靜止狀態(tài)轉向代謝活躍狀態(tài)后中止,然后干燥又回到代謝靜止狀態(tài),這與種子成熟脫水干燥類似,但時間明顯短于后者。 Chen 等[37]研究發(fā)現(xiàn)菠菜引發(fā)種子不論是快速干燥還是慢速干燥均引起了脂質(zhì)過氧化。

3.2.3 引發(fā)誘導脅迫抗性可能機制

引發(fā)處理造成潛在的脅迫主要表現(xiàn)在兩個層次,一是引發(fā)過程中產(chǎn)生的滲透、干旱、氧化等中度脅迫,另一個是引發(fā)后的干燥過程,其中前者誘導了引發(fā)種子在發(fā)芽后產(chǎn)生交叉耐性[46],后者是否誘導引發(fā)種子產(chǎn)生交叉耐性尚不清楚。

3.2.3.1 引發(fā)促進專一蛋白表達

胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白(LEA)是成熟種子中一類重要蛋白(占蛋白質(zhì)總量的5%,占非貯藏蛋白總量的30%),LEA 蛋白的合成和積累與種子發(fā)育期間脫水耐受性的獲得密切相關,其中第二類LEA 蛋白也稱為脫水素(dehydrin,DHNs),會保護細胞因干旱、鹽、冷害造成的脫水損傷。 Chen 等[37]研究發(fā)現(xiàn)PEG滲透引發(fā)菠菜種子過程中,幾種DHNs 蛋白會短暫上調(diào)表達,隨后在干旱脅迫條件下發(fā)芽,引發(fā)種子發(fā)芽率高于未引發(fā)種子,DHNs 蛋白在引發(fā)種子中大量出現(xiàn),而未引發(fā)種子未觀察到DHNs 蛋白,說明引發(fā)種子可能會保持引發(fā)處理誘導的“脅迫反應記憶”,當再次遭遇脅迫時,產(chǎn)生相應的脅迫反應,提高抗逆性。熱休克蛋白(HSP)是引發(fā)誘導脅迫反應積累的另一類蛋白,已在多種作物上報道[35]。

3.2.3.2 引發(fā)過程中的活性氧水平和抗氧化系統(tǒng)

活性氧(ROS)參與有氧代謝的所有重要過程,在呼吸作用和光合作用的電子傳遞過程中形成,活性氧既可以在正常代謝中產(chǎn)生,也在多種環(huán)境脅迫條件下積累,如高光強、低溫、干旱、鹽分、電離輻射、紫外線均可以使植物產(chǎn)生ROS。 活性氧同時也是一種重要的信號分子,可以調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育,程序性細胞死亡,激素信號及脅迫抗性[51]。 適度ROS 的積累是種子萌發(fā)的積極調(diào)節(jié)因子,其可以促進胚乳弱化,通過氧化還原反應激活種子萌發(fā)級聯(lián)信號反應,調(diào)節(jié)糊粉層細胞程序性死亡。 在引發(fā)過程中,種子部分水合與引發(fā)介質(zhì)導致的脅迫反應均誘導有益的ROS 的積累[52-53]。

盡管活性氧在種子萌發(fā)過程中起到重要的作用,但過多的積累會啟動一個級聯(lián)反應,導致對植物有嚴重破壞性的物質(zhì)如羥自由基和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,高水平的ROS,尤其是羥自由基和過氧化氫會對植物細胞造成嚴重傷害,不利于種子萌發(fā),特別在種子滲透引發(fā)過程中,由于水分的限制會引起過多ROS的產(chǎn)生,因此需要嚴格控制ROS 的積累。 植物體內(nèi)存在有效的抗氧化劑系統(tǒng)來減少活性氧傷害,包括ROS 清除酶(超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶)和谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán)、維生素E 及維生素A。 Bailly 等[54]發(fā)現(xiàn)種子引發(fā)過程中,種子抗氧化劑活性增強,引發(fā)種子重新萌發(fā)時,在萌發(fā)及幼苗早期比未引發(fā)種子表現(xiàn)更強的抗氧化劑活性。 這與引發(fā)中LEA 蛋白的積累類似,存在“記憶效應”。

3.3 引發(fā)打破種子休眠

休眠是指能正常吸水并且具有代謝活性的種子在合適的條件下不能正常萌發(fā)的現(xiàn)象。 種子引發(fā)技術可以應用解除某些種子的休眠現(xiàn)象。

3.3.1 引發(fā)解除種子休眠的應用

引發(fā)處理解除生菜種子高溫休眠是一項廣泛的商業(yè)性應用,在美國加利福尼亞地區(qū)沙漠地區(qū),生菜種子播種于溫暖的秋天,大多數(shù)生菜品種種子在20—30 ℃萌發(fā)受到抑制,引發(fā)處理使種子可以度過吸脹時的高溫,促進萌發(fā)過程。 需光種子發(fā)芽必須至少部分水合來響應光信號,對于丸?；路N子,由于涂層會阻擋光纖的滲透,引發(fā)處理可以克服這一困難。 甜菜種子中含有萌發(fā)抑制劑,生產(chǎn)上一般通過浸泡法濾去萌發(fā)抑制劑,通常與引發(fā)處理結合,共同發(fā)揮作用,在有效解除休眠的同時促進種子發(fā)芽。

3.3.2 引發(fā)打破生菜種子休眠機理研究

Bewley 等[55]對引發(fā)打破生菜種子休眠作用從基因表達上進行了深入研究,發(fā)現(xiàn)在低溫條件下吸脹的生菜種子中,參與脫落酸合成的基因(LsNCED4)表達量下降,參與赤霉素和乙烯合成的相關基因(如LsGA3oxl 和LsACS1)的表達量增加,相反在高溫下吸脹會誘導熱抑制作用,低溫下的表達趨勢被逆轉,維持LsNCED4 高水平的mRNA 含量,而LsGA3oxl 和LsACS1 不表達。 在種子引發(fā)期間,LsNCED4 的mRNA含量下降,而LsGA3oxl 和LsACS1 的mRNA 含量增加,經(jīng)過干燥后,引發(fā)種子仍能保持較低水平的LsNCED4 表達,較高水平的LsGA3oxl 和LsACS1 表達,并在隨后的高溫吸脹期間這些趨勢不會逆轉。 因此,引發(fā)技術能使種子順利度過高溫抑制作用,有利于萌發(fā)完成。

4 討論與展望

種子活力是種子的重要品質(zhì),高活力種子田間出苗率高、整齊,抗逆性強,耐貯性好,可以節(jié)約播種費用,增加作物產(chǎn)量,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有非常重要的作用。 種子引發(fā)可以顯著提高種子活力水平已被生產(chǎn)實踐證明。 種子是活的有機體,同一作物種子活力主要由種子發(fā)育、成熟期間或收獲前的環(huán)境因素決定,受地域、天氣、收獲時間等影響,種子生產(chǎn)中不可能總能保持理想狀態(tài),每粒種子所經(jīng)歷的發(fā)育過程不同,活力高低也不同。 種子批活力達到最高峰后就開始衰老下降,種子引發(fā)提高種子活力的應用說明種子衰老變化開始后一段時間,其所產(chǎn)生的代謝變化是可逆轉的,可能存在臨界值,在臨界值以前,種子活力可以通過引發(fā)等方法恢復或部分恢復到初始最佳狀態(tài)。 種子引發(fā)可能重新模擬了部分種子發(fā)育過程,在相對理想的條件下完成了種子生理生化代謝,并在隨后理想的回干過程完成種子活力的恢復或提升。 種子引發(fā)提高抗逆性可能與交叉耐性有關,合適的引發(fā)條件可以將引發(fā)過程中發(fā)生的生理生化代謝“記憶”固定,當再次遭遇到類似不利萌發(fā)條件時,迅速啟動先前經(jīng)歷過的代謝反應。 引發(fā)處理類似人們表演前的彩排活動,種子預發(fā)芽的過程可能被種子“記憶”并熟悉,當再次萌發(fā)時生理生化代謝效率提高,發(fā)芽時間縮短。 目前報道引發(fā)技術的不利效應是種子的可儲存時間縮短,但并非總是如此,也有研究表明引發(fā)處理會延長種子的儲存壽命。 研究結果的差異可能有多種原因,如引發(fā)方法、作物種類、品種、干燥方式等,其中引發(fā)處理后的干燥條件是最重要的,干燥的速率和程度影響隨后的儲存壽命,緩慢或分期干燥相比快速干燥會有利于種子的儲存。 種子引發(fā)效果因品種、種子批而不同,具體技術需要精準控制引發(fā)處理的水分、溫度、時間等參數(shù),不適條件會降低發(fā)芽勢甚至導致種子批報廢,因此常規(guī)商業(yè)引發(fā)處理一般需要1 個月,近年來瑞典奈爾松種子發(fā)展公司研發(fā)的種子活化設備的出現(xiàn),使引發(fā)技術向自動化、快速化方向發(fā)展,將成為未來引發(fā)技術應用的主要方向。 在引發(fā)機理研究方面,研究者已從生理代謝、蛋白表達譜等方面進行了深入研究,利用表觀遺傳學進行種子引發(fā)機理的研究可能將是今后重要的發(fā)展方向。