張樹(shù)山,韓雪峻,姜紅菊,戴建軍,吳彩鳳,孫玲偉,張德福?

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物遺傳工程研究室,上海201106;2上海祥欣畜禽有限公司∕上海種豬工程技術(shù)研究中心,上海201302)

1992 年聯(lián)合國(guó)環(huán)境與發(fā)展大會(huì)上通過(guò)了《生物多樣性公約》,首次提出了家畜遺傳資源保護(hù)在全世界范圍內(nèi)保障食品安全和滿(mǎn)足需求具有重要的意義,極大地推動(dòng)了全球范圍內(nèi)家畜遺傳資源保護(hù)進(jìn)程。 目前,動(dòng)物遺傳資源保存(即“保種”)主要有“動(dòng)態(tài)保種”和“靜態(tài)保種”兩種方式。 “動(dòng)態(tài)保種”[1]即傳統(tǒng)的活體保種,需要專(zhuān)門(mén)建立以群體為保種對(duì)象的保種場(chǎng)、保種基地,需要維持一定數(shù)量個(gè)體的保種群并制定合理的選種選配方案,維持成本較高且面臨著疾病、疫情和自然災(zāi)害等風(fēng)險(xiǎn)。 “靜態(tài)保種”[2](即生物技術(shù)保種,對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行冷凍保存),一般指通過(guò)對(duì)保種群體部分或全部的配子(精子和卵母細(xì)胞)、胚胎、體細(xì)胞和DNA 等進(jìn)行冷凍保存( -196 ℃)建立動(dòng)物“遺傳資源庫(kù)”(或“基因庫(kù)”),具有占地少、可完全不受外界疾病、疫情影響,但其應(yīng)用對(duì)相關(guān)技術(shù),如配子冷凍、輸精∕移植、體細(xì)胞克隆等要求較高。

我國(guó)地方豬遺傳資源豐富,但目前部分品種已滅絕或?yàn)l臨滅絕,傳統(tǒng)的活體保種方式抵抗疫情、自然災(zāi)害等的能力十分有限,迫切需要“靜態(tài)保種”手段對(duì)我國(guó)現(xiàn)有地方豬種遺傳資源進(jìn)行有效的備份,從而提高其遺傳資源保護(hù)的可靠性。 近年來(lái),尤其隨著豬精液冷凍保存、克隆等技術(shù)日益成熟,表明“靜態(tài)保種”已成為可部分替代傳統(tǒng)保種的切實(shí)可行的手段。

1 我國(guó)地方豬種遺傳資源保護(hù)現(xiàn)狀和緊迫性

我國(guó)地域遼闊,不同地區(qū)文化、民族風(fēng)俗和飲食喜愛(ài)等的多元化及復(fù)雜多樣的自然環(huán)境孕育出了約占世界豬種數(shù)1∕3 的豬品種,是大自然和先人留給我們的寶貴遺產(chǎn)。 然而自改革開(kāi)放以來(lái),我國(guó)育種者和生產(chǎn)者受高生長(zhǎng)速率、高瘦肉率等指標(biāo)為主的需求導(dǎo)向影響,重引進(jìn)、輕本土品種理念占主導(dǎo)地位,地方品種的選育工作進(jìn)展緩慢[3]。 此外,近20 年來(lái)我國(guó)快速城市化、工業(yè)化對(duì)地方豬種活體保種空間的擠壓、對(duì)本土豬遺傳資源重視程度不夠及保種措施不當(dāng)?shù)纫蛩?造成我國(guó)大量地方豬種原有的優(yōu)良性狀逐漸退化,部分品種甚至絕種或已瀕臨絕種。 如河北省的定縣豬、江蘇橫涇豬已證實(shí)絕種,福州黑豬、莆田黑豬、廣東大花白豬和藍(lán)塘豬等多個(gè)地方品種已處于瀕臨絕種邊緣。

依照原農(nóng)業(yè)部2006 年頒布的《畜禽遺傳資源保種場(chǎng)保護(hù)區(qū)和基因庫(kù)管理辦法》中提出的國(guó)家級(jí)地方豬種資源保護(hù)場(chǎng)標(biāo)準(zhǔn),有50 個(gè)以上地方豬保種場(chǎng)符合條件。 共計(jì)有42 個(gè)地方豬品種被列入國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄(農(nóng)業(yè)部公告第2061 號(hào))。 傳統(tǒng)保種要求具有良好生物隔離的專(zhuān)門(mén)場(chǎng)地且需要一定的維持費(fèi)用,相當(dāng)部分專(zhuān)門(mén)化保種場(chǎng)虧損嚴(yán)重而難以完成保種目標(biāo)。

眾所周知,豐富的地方豬種資源是一個(gè)國(guó)家的戰(zhàn)略資源,是目前和未來(lái)豬育種工作的基本素材,地方豬種遺傳資源保護(hù)開(kāi)始受到各界人士和政府的關(guān)注和重視。 隨著人民生活水平的不斷提高,我國(guó)豬肉消費(fèi)需求已步入“量穩(wěn)質(zhì)升”階段,消費(fèi)者開(kāi)始注重豬肉的品質(zhì)。 這意味著,培育優(yōu)質(zhì)生態(tài)豬肉的品種必須要有豐富的地方豬種資源作為支撐。 此外,從2018 年開(kāi)始非洲豬瘟給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大沖擊至今,這一影響也給傳統(tǒng)的活體保種敲響了生物安全警鐘。 僅憑傳統(tǒng)的活體保種方式存在較大的生物安全風(fēng)險(xiǎn),采用“靜態(tài)保種”的手段對(duì)地方豬種遺傳資源進(jìn)行備份顯得尤為重要。

2 家畜“靜態(tài)保種”研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 靜態(tài)保種涉及相關(guān)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

“靜態(tài)保種”涉及技術(shù)主要包括配子和胚胎等細(xì)胞∕組織的冷凍保存及人工輸精、胚胎移植和體細(xì)胞克隆等遺傳資源的使用技術(shù),這些技術(shù)的發(fā)展水平直接決定其能否廣泛應(yīng)用。

2.1.1 豬精液冷凍保存技術(shù)

該技術(shù)一般指對(duì)大體積豬精液通過(guò)離心濃縮、添加保護(hù)成份并經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)慕禍仄胶夂屠鋬?使精子細(xì)胞的代謝幾乎完全停止,從而達(dá)到長(zhǎng)期保存( -196 ℃)的目的。 豬精液冷凍保存技術(shù)研究最早始于20世紀(jì)50 年代,一直到70 年代才有使用冷凍精液產(chǎn)仔報(bào)道[4]。 豬冷凍精液劑型主要有顆粒、細(xì)管(0.5 mL和5 mL)和扁平袋(5 mL)等,目前以與程序化冷凍儀和精液灌封機(jī)等標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)設(shè)備相配套的0.5 mL細(xì)管為主。 豬的顆粒和細(xì)管冷凍精液1975 年就開(kāi)始用于豬育種,但受制于精液冷凍和輸精技術(shù)水平,直到本世紀(jì)初使用冷凍精液的母豬數(shù)量還不到1%[5]。 近十幾年來(lái),國(guó)內(nèi)外豬精液冷凍技術(shù)發(fā)展主要聚焦在以下幾方面并取得了較大突破:(1)冷凍稀釋液研發(fā)主要在冷凍保護(hù)劑、抗氧化、抗菌等成分篩選、添加試驗(yàn),已有多個(gè)品牌的商業(yè)化冷凍稀釋粉(液);(2)精準(zhǔn)降溫的程序化降溫儀問(wèn)世,可實(shí)現(xiàn)豬精子冷凍降溫速率實(shí)現(xiàn)最優(yōu)化;(3)豬精液冷凍專(zhuān)用的精液分裝、細(xì)管打印和封口等設(shè)備研發(fā)。 使豬冷凍精液規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化的商業(yè)生產(chǎn)成為可能;(4)與冷凍精液相配套的母豬發(fā)情鑒定和深部位輸精技術(shù)研究,大幅度提高了豬冷凍精液的實(shí)用價(jià)值。 迄今為止,國(guó)際上已經(jīng)召開(kāi)了八次關(guān)于豬精液冷凍保存的大型國(guó)際會(huì)議,對(duì)豬精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用起到了積極的推動(dòng)作用[6]。 我國(guó)豬精液冷凍保存技術(shù)研究雖略晚于國(guó)外,但巨大的市場(chǎng)需求極大推動(dòng)了我國(guó)豬冷凍精液商業(yè)化生產(chǎn)進(jìn)程開(kāi)始步入商業(yè)化生產(chǎn)和大面積推廣階段[7]。

2.1.2 胚胎∕卵母細(xì)胞冷凍保存技術(shù)

理論上講,胚胎含有動(dòng)物個(gè)體所有的遺傳信息,卵母細(xì)胞僅包括雌性動(dòng)物遺傳物質(zhì)。 冷凍的胚胎∕卵母細(xì)胞保存不再受時(shí)空限制,在豬遺傳資源的保護(hù)均具有重要意義,可以作為傳統(tǒng)保種體系的有效補(bǔ)充。胚胎和卵母細(xì)胞冷凍方法類(lèi)似,先后歷經(jīng)慢速冷凍法、快速冷凍法和玻璃化冷凍法,前二者需要昂貴的程序冷凍儀,后來(lái)的玻璃化冷凍法采用將胚胎或卵母細(xì)胞含高濃度冷凍保護(hù)劑的冷凍液里,直接投入液氮快速冷凍,具有操作簡(jiǎn)單、對(duì)儀器要求低和冷凍效果好等優(yōu)點(diǎn),已逐漸取代傳統(tǒng)方法成為目前家畜胚胎∕卵母細(xì)胞冷凍保存的主要手段。 與其他動(dòng)物相比,豬的胚胎和卵母細(xì)胞均含有較高比例的脂肪成分,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)容易在冷凍-解凍過(guò)程發(fā)生不可逆性損傷,這是豬胚胎和卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)進(jìn)展緩慢的主要原因[8-9]。 豬胚胎和卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)難度較大,雖然20 世紀(jì)90 年代豬冷凍胚胎移植就已成功產(chǎn)下仔豬,但至今仍沒(méi)有較大突破[10]。 由于冷凍卵母細(xì)胞需要額外經(jīng)歷體外受精操作,豬的冷凍卵母細(xì)胞的應(yīng)用難度明顯高于冷凍胚胎,直到2014 年和2015 年才有處于GV 期[11]和MII 期[12]冷凍卵母細(xì)胞上獲得存活后代。 另外,冷凍豬胚胎保存技術(shù)應(yīng)用也受胚胎移植技術(shù)水平制約,冷凍豬卵母細(xì)胞則受體外受精和胚胎移植兩方面因素影響。 目前豬的胚胎移植主要采用常規(guī)手術(shù)或腹腔鏡微創(chuàng)手術(shù),對(duì)操作人員和移植條件要求較高,對(duì)母豬維持妊娠有一定負(fù)面影響。 在科研人員不懈努力下,已有非手術(shù)法豬胚胎移植專(zhuān)用的商品化器械問(wèn)世,大大降低了技術(shù)難度[13-14]。

2.1.3 體細(xì)胞的冷凍保存與體細(xì)胞克隆技術(shù)

1997 年,英國(guó)科學(xué)家利用體細(xì)胞核移植成功獲得世界首例克隆綿羊[15],隨后在牛[16-17]、山羊[18]和豬[19-20]等家畜先后獲得成功。 這意味著可以從任意一頭家畜采集體細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng)、構(gòu)建細(xì)胞庫(kù)和冷凍保存,在需要的時(shí)候解凍體細(xì)胞后采用體細(xì)胞核移植的方法克隆出大量與供體遺傳信息一致的個(gè)體[21]。 該方法可在不影響生產(chǎn)的情況下大批量地采集公、母畜的體細(xì)胞,細(xì)胞采集、培養(yǎng)和建庫(kù)等流程可行性高、成本低。 但受制于傳統(tǒng)體細(xì)胞克隆對(duì)儀器和操作技能較高要求,多年來(lái)家畜體細(xì)胞的冷凍保存一直不被重視。 近幾年手工克隆技術(shù)(即徒手克隆)[22]的問(wèn)世,大幅度地降低了豬的克隆成本和技術(shù)難度,為體細(xì)胞冷凍保存在豬靜態(tài)保種中的應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ),具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.2 國(guó)內(nèi)外家畜“靜態(tài)保種”手段在家畜遺傳資源保護(hù)中應(yīng)用及現(xiàn)狀

目前,在畜牧業(yè)高度良種化和集約化的歐美發(fā)達(dá)國(guó)家中,原有眾多品種減少到少數(shù)經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的品種和雜交品種,畜禽遺傳資源相對(duì)匱乏。 而在一些發(fā)展中國(guó)家,由于良種化程度較低和地域相對(duì)封閉等因素,使得一些原有本土品種得以幸存。 在過(guò)去全球經(jīng)濟(jì)一體化進(jìn)程中,發(fā)展中國(guó)家常常忽視本土原有畜禽遺傳資源保護(hù),一味通過(guò)大量引進(jìn)外來(lái)品種提高畜牧業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益,已造成原有地方畜禽品種數(shù)量急劇減少。

美國(guó)政府從20 世紀(jì)90 年代至21 世紀(jì)初,先后啟動(dòng)了多個(gè)畜禽遺傳資源保護(hù)項(xiàng)目,調(diào)查了本土畜禽品種的數(shù)量和地理分布信息,詳細(xì)測(cè)定了每個(gè)品種的特性(如外形、育種值和對(duì)環(huán)境適應(yīng)性等),并通過(guò)全美遺傳資源信息網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)了信息共享;收集并冷凍保存了奶(肉)牛、豬、綿羊和山羊等家畜的遺傳物質(zhì)(如精液、胚胎、卵母細(xì)胞和DNA 等),并建立了用于檢索的電子數(shù)據(jù)庫(kù)[23-24]。 美國(guó)已建成一個(gè)國(guó)家級(jí)的畜禽“基因庫(kù)”,收集了列入國(guó)家保種規(guī)劃的畜禽品種(包括一些外來(lái)品種)的遺傳資源[24]。

盡管同在歐盟體系下,英國(guó)、法國(guó)和荷蘭等國(guó)均建立自己了國(guó)家級(jí)的畜禽“基因庫(kù)”,對(duì)畜禽瀕危品種、具有優(yōu)異性能的非瀕危品種和育種群的典型樣本等的精液、胚胎等遺傳物質(zhì)進(jìn)行有效冷凍保存[25-26]。巴西和印度在畜禽“基因庫(kù)”建設(shè)上也取得了不俗的成績(jī)。 如,巴西國(guó)家遺傳資源與生物技術(shù)研究中心下屬“基因庫(kù)”共計(jì)保存了牛、山羊、綿羊、馬和驢等14 個(gè)品種的52 230 劑冷凍精液和220 枚胚胎[27];印度的國(guó)家動(dòng)物遺傳資源局下屬的“基因庫(kù)”已收集了多達(dá)31 個(gè)畜禽品種97 835 劑冷凍精液(來(lái)自257 頭種公畜)[28]。 前蘇聯(lián)至少冷凍保存了26 個(gè)品種192 頭公牛的12.3 萬(wàn)份精液和33 個(gè)品種252 只公羊的45.6 萬(wàn)份精液[29]。

我國(guó)家畜遺傳資源的保護(hù)工作幾乎與歐美發(fā)達(dá)國(guó)家同步,面對(duì)需要保存的地方畜禽品種數(shù)量較多。從1986 年開(kāi)始,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧研究所在四年里建成包括來(lái)自4 個(gè)牛品種和3 個(gè)綿羊品種的冷凍“精子庫(kù)”,共計(jì)34 091 份;從1996 年到2000 年,全國(guó)畜牧總站畜禽遺傳資源保存利用中心初步建立志家畜種質(zhì)基因庫(kù)(國(guó)家家畜基因庫(kù)前身),基因庫(kù)由冷凍精液(牛和豬)、冷凍胚胎(牛和豬)及家禽的血樣和DNA 等遺傳物質(zhì),并建立了生物技術(shù)保種(即“靜態(tài)保種”)技術(shù)規(guī)程和遺傳物質(zhì)安全管理規(guī)范,以及牛、豬和羊等家畜的DNA 數(shù)據(jù)庫(kù)[30]。

中國(guó)政府十分重視利用“靜態(tài)保種”手段建立畜禽“基因庫(kù)”工作,先后頒布了《畜禽遺傳資源保種場(chǎng)保護(hù)區(qū)和基因庫(kù)管理辦法》(2006 年7 月)、《中國(guó)國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》(2014 年2 月)等法規(guī),并相繼建立了國(guó)家級(jí)畜禽基因庫(kù)(北京)、國(guó)家級(jí)地方雞種基因庫(kù)(江蘇和浙江各1 個(gè))和國(guó)家級(jí)水禽基因庫(kù)(江蘇和福建各1 個(gè))等[31-32]。 以國(guó)家級(jí)畜禽基因庫(kù)(北京)為例,截至2017 年10 月,該基因庫(kù)共收集和保存了冷凍保存了家畜精液、胚胎和體細(xì)胞等遺傳物質(zhì)共計(jì)39.4 萬(wàn)份以上。 其中,牛、羊、豬和馬等家畜冷凍精液35 萬(wàn)份,共涉及86 個(gè)品種;來(lái)自51 個(gè)品種的牛、羊冷凍胚胎1.2 萬(wàn)枚;采集、培養(yǎng)和冷凍保存了牛、羊、豬和馬等家畜耳成纖維細(xì)胞8 000 份以上,共31 個(gè)品種[33]。

我國(guó)地方農(nóng)科院系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位在豬地方品種遺傳資源保存也做出巨大貢獻(xiàn)。 2002 年,江西農(nóng)業(yè)大學(xué)建成國(guó)內(nèi)最完備的地方豬種資源基因組DNA 庫(kù)。 該庫(kù)采集了國(guó)內(nèi)現(xiàn)存的70 個(gè)地方豬種(群)、4 000多個(gè)豬個(gè)體的血樣和組織樣,提取并保存了1.2 萬(wàn)份DNA 樣品;重慶畜牧科學(xué)院建立了榮昌豬的冷凍“精子庫(kù)”[34];上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所從20 世紀(jì)90 年代至今,對(duì)上海地區(qū)地方豬品種和培育品種遺傳資源進(jìn)行了有效保存,初步建立了上海白豬(農(nóng)系、上系)、梅山豬和浦東白豬等多個(gè)品種的冷凍精子庫(kù)、體細(xì)胞庫(kù),及相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)[21,35-36]。

綜上,豬精液冷凍保存-深部位輸精技術(shù)體系已發(fā)展成熟,豬冷凍精液已步入商業(yè)化生產(chǎn)并在育種得到了廣泛應(yīng)用,冷凍精液是目前針對(duì)公豬性?xún)r(jià)比最高的“靜態(tài)保種”手段;玻璃化冷凍法的問(wèn)世大大降低胚胎∕卵母細(xì)胞冷凍的技術(shù)難度和成本,并提高了二者的冷凍效果,二者的應(yīng)用價(jià)值也隨著體外受精和胚胎非手術(shù)移植方法的優(yōu)化而提高;豬體細(xì)胞冷凍保存也是一種被廣泛看好的“靜態(tài)保種”手段,基于前期細(xì)胞采集、培養(yǎng)和冷凍保存等過(guò)程具有較高可行性,可以對(duì)整個(gè)保種群體實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞冷凍保存,這樣就可在必要的時(shí)候?qū)δ承﹤€(gè)體進(jìn)行按需“復(fù)制”。 此外,還應(yīng)該以前瞻性的眼光來(lái)看問(wèn)題,不能因?yàn)槟撤N遺傳物質(zhì)目前的應(yīng)用價(jià)值較低而忽視,其價(jià)值極有可能在未來(lái)因某項(xiàng)技術(shù)的突破而大幅度提升。

3 結(jié)論

從2018 年開(kāi)始影響至今的非洲豬瘟對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)和地方豬種質(zhì)資源保護(hù)均造成了巨大沖擊,使仍以活體保種為主的地方豬種面臨滅絕的風(fēng)險(xiǎn)。 豬種質(zhì)資源是一個(gè)國(guó)家的戰(zhàn)略資源,是今后開(kāi)展豬育種工作的基本素材,對(duì)我國(guó)未來(lái)豬育種和養(yǎng)豬業(yè)實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展至關(guān)緊要。 通過(guò)政府的政策導(dǎo)向和資金支持,加強(qiáng)科研院所、豬育種企業(yè)和專(zhuān)門(mén)保種場(chǎng)的“產(chǎn)-學(xué)-研”合作、形成合力,以現(xiàn)有“靜態(tài)保種”手段為現(xiàn)存的地方豬種做好遺傳資源的備份,具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。