李會賢,趙 晶,姚春霞,黃柳娟,馮 博,王 華,王衛(wèi)國,邵 毅?

(1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306;2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,上海201403;3華東師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,上海200241;4 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室,上海201403;5美國俄亥俄州立大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)系,哥倫布43210;6復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200433;7上海國榮果業(yè)專業(yè)合作社,上海201516)

抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的過量應(yīng)用易引發(fā)細菌產(chǎn)生耐藥性(AR),會對環(huán)境和食品的安全造成嚴(yán)重影響。除了動物源性農(nóng)產(chǎn)品,研究人員在蔬果產(chǎn)品中也發(fā)現(xiàn)了耐藥菌(ART)[1-2],但其污染來源尚不明確。 栽培要素中的土壤[3-4]、灌溉水[5]、糞肥[6]∕有機肥[7]、甚至空氣[8]中富含的ART 菌和AR基因,都是蔬果表面ART 菌的潛在來源;此外,土壤中的抗生素殘留也有可能對蔬菜內(nèi)生菌造成耐藥壓力[9]。 揭示種植過程中各栽培要素及種植操作對蔬果產(chǎn)品,特別是對即食蔬果產(chǎn)品中ART 菌的影響,是保證其微生物安全性的基礎(chǔ)。

目前,有關(guān)農(nóng)產(chǎn)品中ART 菌的研究主要集中在致病菌的耐藥性篩查和耐藥機制等方面[10-11]。 但致病菌僅占整個細菌生態(tài)系統(tǒng)中的很小一部分,且諸多證據(jù)表明,多種非致病菌均可成為AR基因的供體、受體及中間體,對AR基因的水平遷移擴散具有重要作用[12]。 目前,已在蔬果中發(fā)現(xiàn)了大量的AR基因移動原件[13],表明蔬果中AR基因水平遷移現(xiàn)象的存在。 因此,亟需在整個細菌生態(tài)系統(tǒng)范圍內(nèi)展開研究,以揭示不同栽培要素和操作對蔬果產(chǎn)品中的ART 菌發(fā)生的影響。 本研究通過盆栽試驗,探究單次施用有機肥對采摘期生菜及其栽培土壤中7 類ART 菌數(shù)量以及8 種AR基因存在情況的影響,為揭示鮮食生菜表面耐藥菌的污染來源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

1.1.1 生菜栽培、施肥處理及采樣

生菜栽培試驗在上海普南園藝場進行,周邊無大型養(yǎng)殖場。 盆栽試驗共設(shè)2 個處理組,分別為未施用有機肥組(CK)和施用有機肥組(OMT,Organic manure treated)。 在50 cm(長) × 20 cm(寬) × 20 cm(深)的塑料盆中裝4∕5 盆土(5 kg),OMT 組在土壤表面施加當(dāng)?shù)剞r(nóng)資店購買的商品化雞糞肥200 g(有機肥與土壤的質(zhì)量比為1∶25),一次性施入并混勻。 大小及葉片數(shù)量均一致的生菜苗于施肥當(dāng)天移植入塑料盆中,苗間距一致,每盆8 棵,每組3 盆。 栽培期間用自來水作為灌溉水源。 栽培0 d、30 d 和45 d 后從每個盆中隨機采集干凈的生菜葉和根層(土壤表層3—4 cm)土壤樣品,于冰盒中存放,并于當(dāng)天運回實驗室進行耐藥菌的分離。

1.1.2 市售生菜及處理

市售生菜產(chǎn)品購自上海市大型菜場,采后于冰盒中存放,2 h 內(nèi)運回實驗室,清洗10 min 或浸泡30 min后篩查耐藥菌。

1.2 儀器與試劑

1300 SERIES A2 型生物安全柜,美國Thermo Fisher Scientific 公司;SX-500 型高壓滅菌鍋,日本TOMY公司;BAGMIXER400 型勻漿機,法國Interscience 公司;Medcenter Einrichtungen GmbH 型恒溫培養(yǎng)箱,德國Friocell 公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀和核酸電泳系統(tǒng),美國Bio-rad 公司;全自動凝膠成像系統(tǒng),上海復(fù)日科技有限公司。

抗生素粉末四環(huán)素(Tetracycline,TET)、強力霉素(Doxycycline,DOX)、磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole,SUL)和三甲氧芐氨嘧啶(Trimethoprim,TRI)、頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、紅霉素(Erythromycin,ERM)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)、萘啶酸(Nalidixic acid, NDA) 購自美國 Sigma 公司; 放線菌酮(Cycloheximide,CYC)購自美國Amresco 公司;腦心浸液肉湯(Brain heart infusion,BHI)瓊脂培養(yǎng)基購自英國Oxoid 公司; PCR 試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR 引物[14]由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 可培養(yǎng)耐藥菌的篩查和計數(shù)

10 g 土壤、生菜或雞糞肥樣品分別與90 mL 0.9%的生理鹽水裝入無菌袋中,用勻漿機拍打10 min,10 倍梯度依次稀釋,每個濃度梯度分別取200 μL 懸濁液均勻涂布于含有16 μg∕mL TET、16 μg∕mL DOX、152 μg∕mL SUL 和8 μg∕mL TRI、4 μg∕mL CTX、100 μg∕mL ERM、4 μg∕mL CIP 或8 μg∕mL NDA 的BHI 培養(yǎng)基平板上[15]。 每個培養(yǎng)基平板內(nèi)均含有100 μg∕mL CYC 以抑制酵母菌和霉菌的生長。 平板倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48 h 后進行可培養(yǎng)耐藥菌的菌落計數(shù)。 樣品均質(zhì)液梯度稀釋后涂布于不含抗生素僅含CYC 的BHI 平板中,30 ℃培養(yǎng)48 h 后進行可培養(yǎng)總菌的菌落計數(shù)。 每個樣品重復(fù)3 次。

1.3.2 耐藥基因的篩查

根據(jù)菌落形態(tài),在每個采樣點隨機挑取至少25 株具有四環(huán)素耐藥表型或磺胺耐藥表型的細菌,用PCR 法篩查8 個耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetG、tetL、tetM、sul1、sul2 和一類整合酶基因intI[14]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

生菜、土壤和有機肥中ART 菌的計數(shù)結(jié)果及耐藥菌占總菌的比例用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)表示。 用SPSS 16.0 軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)方法比較處理組與對照組中耐藥菌占總菌的百分比的差異顯著性,當(dāng)P＜0.05 時,差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 市售生菜中可培養(yǎng)耐藥菌的計數(shù)

市售生菜表面普遍存在耐藥菌,除未發(fā)現(xiàn)強力霉素耐藥菌(DOXr)外,對本研究涉及的幾種抗生素耐藥的細菌均有不同程度檢出,甚至在清洗10 min 或浸泡30 min 后的生菜中仍檢出一定水平具有耐藥表型的細菌(表1)。

表1 市售生菜中可培養(yǎng)總菌和耐藥菌數(shù)量Table 1 Counts of cultivable total bacteria and ART bacteria in lettuce samples from markets

2.2 有機肥、土壤與生菜苗中可培養(yǎng)耐藥菌的本底水平

雞糞肥中能檢出7 種耐藥菌,其計數(shù)均高于106CFU∕g,比土壤和生菜苗中可培養(yǎng)耐藥菌的本底水平高1—6 個數(shù)量級。 有機肥中除CTXr和SULr外,其余耐藥菌占總菌比例均高于土壤。 土壤和生菜苗中均未發(fā)現(xiàn)DOXr,土壤中其他耐藥菌的數(shù)量和占總菌的比例均高于生菜苗,且耐藥菌的數(shù)量高于生菜苗0—1 個數(shù)量級(表2)。 比較有機肥、土壤與生菜苗中耐藥菌的本底水平,推測富含大量耐藥菌的有機肥通過直接接觸這一途徑將更多的耐藥菌引入土壤環(huán)境,進而在栽培過程中污染生菜產(chǎn)品。

表2 雞糞肥、土壤和生菜苗中可培養(yǎng)耐藥菌本底水平及占可培養(yǎng)總菌的比例Table 2 Background levels and percentages of cultivable antibiotic-resistant bacteria in chicken manure,soil and lettuce samples

2.3 單次施用有機肥對生菜和土壤中可培養(yǎng)耐藥菌數(shù)量的影響

生菜栽培至第30 天和第45 天,其表面CTXr,SULr,NDAr,CIPr,ERMr5 類耐藥菌占總菌的百分比均顯著高于未施肥組,達7.88%—100.00%,是對照組的1.15—10.43 倍;TETr和DOXr僅在栽培45 d 樣品中檢出,其中TETr在對照組和處理組中分別占總菌的0.01%和2.47%,DOXr僅在處理組中發(fā)現(xiàn),占總菌的2.35%[圖1(a)]。 因此,不論是耐藥菌的種類還是數(shù)量,施肥組的生菜均高于對照組,說明單次施用有機肥會提高生菜表面ART 菌的污染水平。 同時,比較未處理組采摘期與0 d 生菜樣品表面的ART 菌(表2),發(fā)現(xiàn)除SULr、TETr和DOXr外,其他4 類ART 菌占總菌的比例均顯著升高,說明除了施肥處理外還有其他因素會導(dǎo)致生菜表面ART 菌的累積。

栽培30 d 和45 d 時,施肥組土壤中可培養(yǎng)耐藥菌占總菌的百分比較CK 組有所增加,增加倍數(shù)因耐藥菌種類不同而不同:30 d 時,TETr、CIPr、NDAr、ERMr和SULr5 種耐藥菌占總菌的百分比提高至對照組的5.52 倍、3.98 倍、1.43 倍、1.27 倍、1.2 倍,45 d 時提高至對照組的513.74 倍、15.63 倍、2.35 倍、22.21 倍、2.15 倍;30 d 時,對照組和施肥組的CTXr占總菌的百分比并無差異,而到45 d 時,施肥組中CTXr的百分比略高于不施肥組,是其1.27 倍;30 d 時,兩組土壤中均未檢出DOXr,但在45 d 施肥組中檢出,為1.66 ×102CFU∕g,占總菌的0.48%[圖1(b)]。

2.4 單次施用有機肥對生菜和土壤中耐藥基因的影響

為了在分子水平進一步確認(rèn)單次施用有機肥對生菜表面和土壤細菌耐藥性的影響,在隨機選取的具有耐藥表型細菌菌落中篩查了6 個tet基因(tetA、tetB、tetC、tetG、tetL和tetM)、2 個sul基因(sul1 和sul2)和指示基因水平遷移潛勢的一類整合酶基因intI的存在情況。 結(jié)果表明,有機肥處理組的采摘期生菜和土壤中3 類基因的檢出率均高于對照組(圖2),表明單次施用有機肥可增加生菜及其栽培土壤中細菌的耐藥性和AR基因水平遷移的潛勢;苗期生菜未發(fā)現(xiàn)3 類耐藥相關(guān)基因,可能與其四環(huán)素和磺胺耐藥水平較低(表2),獲得的用于基因檢測的菌落數(shù)(4 個)較少有關(guān);土壤菌落樣品中未檢出tetA,生菜表面菌落樣品中未檢出tetC和tetM,與已有報道[16]有所不同,可能與所施用的有機肥中AR基因組成不同有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

已有研究證實,施用發(fā)酵有機肥會增加土壤中AR基因數(shù)量[17],施肥可能是耐藥微生物及AR基因進入土壤環(huán)境的主要途徑[18]。 本研究結(jié)果表明,處于采摘期的生菜(栽培30 d 或45 d)表面存在大量ART菌,且有機肥施用組的土壤和生菜中篩查到的ART 菌種類和水平以及AR基因的檢出率均高于對照組,說明單次施用有機肥不僅提高土壤耐藥菌的污染水平,還會影響生菜表面耐藥菌的數(shù)量和種類,帶來環(huán)境和食用方面的雙重風(fēng)險,因此應(yīng)格外重視養(yǎng)殖場用藥管理和糞便處理措施,以達到控制和減滅抗生素耐藥菌的目的。

研究表明,耐藥菌除了在抗生素篩選壓下被誘導(dǎo)、選擇性富集外,耐藥基因還會通過水平基因遷移(HGT)途徑進行傳播和擴散[12]。 本研究在生菜和土壤樣品中均發(fā)現(xiàn)了較高水平的intI基因,推測生菜表面ART 菌的富集過程中發(fā)生了HGT,但哪類細菌參與了HGT 的發(fā)生、相關(guān)AR基因是否有可能遷移至人類共生菌中等問題值得深入研究。 此外,生菜、土壤和有機肥中ART 菌的同源性分析及AR基因和移動元件的遷移潛勢研究,有助于揭示有機肥施用對生菜AR 菌污染影響的分子機制。