余昌霞,李正鵬,趙 妍,查 磊,汪 虹,楊煥玲,陳明杰,郭 倩

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室,國家食用菌工程技術(shù)研究中心,國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)中心,上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室,上海201403)

隨著食用菌工廠化的發(fā)展,食用菌液體菌種在工廠化生產(chǎn)中已被廣泛應(yīng)用。 液體菌種因其具有生長迅速、菌齡整齊、制種簡便、使用方便、接種點多、萌發(fā)和現(xiàn)蕾快、周期短等優(yōu)點,受到工廠化生產(chǎn)的青睞,同時可降低生產(chǎn)成本,提高產(chǎn)品質(zhì)量,經(jīng)濟效益顯著[1-2]。 目前,液體菌種已在金針菇[3-4]、杏鮑菇[5]、蟹味菇[6]等工廠化企業(yè)廣泛應(yīng)用,香菇液體菌種[7]也在逐步普及。

草菇是最具中國特色的食用菌品種之一,具有較高的市場知名度,售價一直居高不下[8],其生物學(xué)特性也顯示了它是最佳的工廠化栽培品種之一。 目前,草菇產(chǎn)業(yè)將逐步往工廠化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；椭悄芑姆较虬l(fā)展。 多年來,草菇生產(chǎn)中仍采用固體制種方式[9],常規(guī)的固體菌種是采用棉籽殼菌種,經(jīng)過原種、栽培種等復(fù)雜的生產(chǎn)環(huán)節(jié),以及裝瓶、掏瓶、裝袋、滅菌、接種等繁瑣的程序,存在生產(chǎn)周期長、菌齡不一致、操作不便等缺點。 由于草菇生物學(xué)效率較低,因此需要在其制種技術(shù)和栽培技術(shù)方面進行改進。為適應(yīng)新形勢下的草菇產(chǎn)業(yè)大規(guī)模發(fā)展,草菇液體菌種用于草菇工廠化栽培是發(fā)展的趨勢之一。 本研究通過正交試驗分別對草菇液體菌種培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,為草菇液體菌種應(yīng)用于工廠化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

草菇(V.volvacea)‘9715’菌株由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基為美國BD 公司生產(chǎn)的合成培養(yǎng)基,稱取39 g 加水定容至1 L,用于試管和平板培養(yǎng)菌絲。

碳源篩選培養(yǎng)基(g∕L):碳源20,蛋白胨1,磷酸二氫鉀2,硫酸鎂0.5,供試碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、海藻糖。

氮源篩選培養(yǎng)基(g∕L):氮源2,葡萄糖20,磷酸二氫鉀2,硫酸鎂0.5,供試氮源為蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、硫酸銨、硝酸鉀。培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)基(g∕L):葡萄糖25,酵母浸粉4,磷酸二氫鉀1,硫酸鎂1。以上所有培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌15 min。

1.3 碳、氮源的篩選

將保存的菌種活化,即轉(zhuǎn)接至PDA 平板,32 ℃恒溫培養(yǎng)3 d 可得母種。 然后將活化的母種用打孔器打孔,取一定量的菌塊經(jīng)均質(zhì)儀打碎后,接入2%(以15 mm2菌塊計為1%的菌種接種量)的菌液于裝有100 mL 篩選培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中,置于32 ℃、轉(zhuǎn)速150 r∕min 搖床上振蕩培養(yǎng)5 d,收集菌絲測定菌絲生物量,每處理5 個重復(fù)。

1.4 液體菌種配方優(yōu)化

根據(jù)碳、氮源的單因素篩選試驗結(jié)果,分別選取較好的碳源、氮源及KH2PO4和MgSO4,設(shè)計L9(34)正交試驗,對草菇液體菌種的培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化,試驗因素及水平如表1 所示。 接種方法及培養(yǎng)條件同1.3,通過測定菌絲生物量確定培養(yǎng)基的最佳配方。

表1 最佳配方L9(34)正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the L9(34)orthogonal experiment g·L -1

1.5 液體菌種培養(yǎng)條件的確定

經(jīng)正交試驗篩選出草菇液體菌種培養(yǎng)的最佳配方后,再對適宜配方的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。 分別選取接種量、液體裝瓶量、溫度和轉(zhuǎn)速,采用L9(34)正交表確定液體菌種的最佳培養(yǎng)條件,試驗因素及水平如表2 所示,通過測定菌絲生物量確定培養(yǎng)基的最佳配方。

表2 最佳培養(yǎng)條件L9(34)正交試驗因素水平Table 2 Factors and levels of the L9(34)orthogonal experiment

1.6 生物量測定

用無紡布過濾培養(yǎng)結(jié)束的液體培養(yǎng)基中的菌絲,再用蒸餾水沖洗2—3 次,收集菌絲在烘箱中(60 ℃)烘干至恒重,用電子分析天平稱其干重。

1.7 數(shù)據(jù)分析

測得的數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草菇液體菌種培養(yǎng)基配方的確定

2.1.1 不同碳源對草菇菌絲生長的影響

碳源是構(gòu)成細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳架來源的營養(yǎng)物質(zhì),也是生長繁殖的能量來源,為食用菌菌絲生長提供重要的營養(yǎng)。 由表3 可知,草菇菌絲在5 種碳源中均能生長,但以葡萄糖為碳源時,菌絲生物量達(dá)到最高,并顯著高于其他碳源,表明葡萄糖可作為‘草菇9715’菌株液體菌種的最適碳源。

表3 不同碳源對草菇菌絲生長的影響Table 3 Effect of different carbon source on the mycelial growth of V.volvacea g

2.1.2 不同氮源對草菇菌絲生長的影響

氮源是食用菌細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸的主要原料,在深層發(fā)酵中起著重要作用。 由表4 可知,‘草菇9715’在酵母浸粉、牛肉浸膏和蛋白胨中均能很好的生長,而在硝酸鉀和硫酸銨中生長較差,表明草菇利用無機氮的效果不佳,其中以酵母浸粉為氮源時,菌絲生物量最大,極顯著優(yōu)于其他氮源,表明酵母浸粉可作為‘草菇9715’菌株液體菌種的最適氮源。

表4 不同氮源對草菇菌絲生長的影響Table 4 Effect of different nitrogen source on the mycelial growth of V.volvacea g

表5 最佳配方L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Results of the L9(34)orthogonal experiment of optimal cultivation medium

2.1.3 最佳配方的確定

根據(jù)單因子試驗結(jié)果,選擇最適碳源和氮源及KH2PO4和MgSO4作為基本因子,進行L9(34)正交試驗,結(jié)果如表5 所示。 不同處理之間菌絲生物量有一定差異,由極差分析結(jié)果可以看出,RA＞RB＞RD＞RC,極差越大起的作用越大,4 個因素中對菌絲生物量的影響大小依次為:葡萄糖(A) ＞酵母浸粉(B) ＞MgSO4(D) ＞KH2PO4(C),其中MgSO4和KH2PO4的影響較小。 根據(jù)方差分析結(jié)果(表6),葡萄糖對菌絲生物量的影響最為顯著。 在試驗設(shè)計范圍內(nèi),優(yōu)化得到的最佳配方為A3B3C1D2,這與正交試驗表中出現(xiàn)的最大值組合A2B3C1D2不一致,經(jīng)驗證,以組合A3B3C1D2培養(yǎng)的草菇液體每100 mL 菌種菌絲體干重達(dá)到(0.507 9 ±0.022 9)g,優(yōu)于A2B3C1D2,即適合‘草菇9715’菌株液體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖25 g∕L,酵母浸粉4 g∕L,KH2PO41 g∕L,MgSO41 g∕L。

表6 配方正交試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment result of cultivation medium

2.2 草菇液體菌種培養(yǎng)條件的確定

根據(jù)2.1 中優(yōu)化得到的培養(yǎng)基組合作為基本培養(yǎng)基,選擇液體裝瓶量等作為基本因子,進行L9(34)正交試驗,結(jié)果如表7。 不同處理菌絲生物量有一定差異,由極差分析結(jié)果可以看出,RD＞RC＞RA＞RB,4個因素對草菇液體菌種菌絲生物量的影響依次為:轉(zhuǎn)速(D) ＞溫度(C) ＞接種量(A) ＞裝液量(B)。 通過方差分析,四因素中,轉(zhuǎn)速和溫度的影響較為顯著,其中轉(zhuǎn)速的作用最為顯著(表8)。 在試驗設(shè)計范圍內(nèi),優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)條件為A2B3C1D2,即接種量2%,裝瓶量120 mL,溫度32 ℃,轉(zhuǎn)速125 r∕min。

表7 最佳培養(yǎng)條件L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Results of the L9(34)orthogonal experiment of optimal culture conditions

表8 培養(yǎng)條件正交試驗結(jié)果方差分析Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment result of culture conditions

3 結(jié)論與討論

草菇液體菌種生長的影響因素較多,如生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)、培養(yǎng)溫度、接種量等。 液體菌種培養(yǎng)基的優(yōu)化對菌絲生長產(chǎn)生重要的影響,特別是碳、氮源的種類及濃度的選擇優(yōu)化。 任海霞等[10]研究表明,液體培養(yǎng)條件下,適宜草菇菌絲生長的最佳碳源是淀粉,最佳氮源是蛋白胨,最佳碳氮比是10∶1,最佳淀粉濃度是3.0%,草菇菌絲生長的最適溫度為30 ℃,最適pH 為7.0。 張萍等[11]研究了不同碳源、氮源及無機鹽對‘草菇V110’液體培養(yǎng)菌絲生長的影響,結(jié)果表明草菇液體培養(yǎng)較適宜的碳源是蔗糖,氮源是蛋白胨、酵母膏和牛肉膏,無機鹽是KH2PO4。 杜姝蓮等[12]研究表明,‘草菇V238’菌株液體菌種較適宜的葡萄糖濃度為1%—1.5%,最佳生長溫度為33 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r∕min,接種量為5%。 本研究通過單因素篩選試驗,以菌絲生物量作為評價指標(biāo)[13-14],確定了‘草菇9715’液體菌種最適碳源為葡萄糖,最適氮源為酵母浸粉。 結(jié)果表明,草菇菌絲既可以利用單糖也可以利用雙糖物質(zhì)的碳源,且葡萄糖的效果較好,可能是因為小分子碳源可被直接吸收利用,在培養(yǎng)前期可使菌種快速定植,而大分子的碳源需要通過菌絲體分泌的胞外酶水解為葡萄糖后才被利用。 以酵母浸粉為氮源,因其是酵母細(xì)胞經(jīng)過破壁之后的水提取,其營養(yǎng)成分更加豐富而更利于菌絲生長所需。

正交試驗在研究多因素多水平的試驗中具有高效、快速等優(yōu)點,是目前常用的優(yōu)化培養(yǎng)基的方法之一。 本試驗進一步通過正交試驗,對適合‘草菇9715’菌絲生長的液體培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,經(jīng)試驗得到‘草菇9715’液體菌種的最佳配方為葡萄糖25 g∕L,酵母浸粉4 g∕L,KH2PO41 g∕L,MgSO41 g∕L;最佳培養(yǎng)條件為接種量2%,裝瓶量120 mL,溫度32 ℃,轉(zhuǎn)速125 r∕min,此時草菇液體每100 mL 菌種的菌絲生物量可達(dá)(0.602 2 ±0.084 7)g。 本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果有相似之處,也有不同之處,其原因可能是試驗選用的菌種不同或培養(yǎng)基的物料配比差異導(dǎo)致的。 本研究可為草菇工廠化液體菌種的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù),并加快草菇工廠化栽培的進程。