胡小林

(耒陽(yáng)市三都鎮(zhèn)畜牧水產(chǎn)站，湖南 耒陽(yáng) 411228)

豬偽狂犬病(Pseudorabies, PR)可導(dǎo)致發(fā)病仔豬腹瀉、嘔吐和神經(jīng)癥狀，該病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)感染所致，該病對(duì)仔豬和繁殖母豬危害最大，其中母豬感染該病后表現(xiàn)為繁殖障礙性疾病[1，2]。我國(guó)首次于1984年報(bào)道該病，后逐漸流行于我國(guó)大部分地區(qū)，目前PR是威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一[3]。近年來(lái)，多種有效的豬偽狂犬病疫苗在我國(guó)得到推廣與應(yīng)用，但我國(guó)大部分豬場(chǎng)仍為偽狂犬病陽(yáng)性豬場(chǎng)，且該病在散養(yǎng)場(chǎng)流行情況尤為嚴(yán)重。

2019年7月初，湖南省耒陽(yáng)市某散養(yǎng)戶部分新購(gòu)仔豬出現(xiàn)疑似PR感染情況，結(jié)合臨床與實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，判定疫情由PRV感染引起。為了初步分析該地區(qū)PRV流行毒株遺傳變異情況，通過(guò)對(duì)該毒株gE基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序與分析，為相應(yīng)的疫苗種類選擇與防控程序制定提供參考。

1 發(fā)病情況

湖南省耒陽(yáng)市某散養(yǎng)戶于2019年7月初外購(gòu)54頭3周齡育肥仔豬，購(gòu)入時(shí)不知豬群的疫苗免疫程序，且對(duì)豬群沒(méi)有進(jìn)行常見(jiàn)傳染病(如豬圓環(huán)病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征和偽狂犬病等)免疫預(yù)防。1周后部分稍瘦弱豬只出現(xiàn)腹瀉、嘔吐和精神沉郁等癥狀，養(yǎng)殖戶對(duì)全場(chǎng)豬肌肉注射阿莫西林進(jìn)行治療，豬群發(fā)病情況不見(jiàn)好轉(zhuǎn)，且有惡化趨勢(shì)。發(fā)病嚴(yán)重的豬只出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，共有6頭仔豬發(fā)病，全部死亡。

2 臨床癥狀

發(fā)病豬只虛弱、站立困難、精神沉郁；嚴(yán)重腹瀉，肛門粘有糞便，且肛門括約肌無(wú)力；豬只體溫升高至41℃左右，呼吸困難，采食量下降，部分仔豬嘔吐、共濟(jì)失調(diào)。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 細(xì)菌分離鑒定

采集病豬病變組織(如肺、扁桃體和淋巴結(jié)等)進(jìn)行細(xì)菌分離。用火焰灼燒過(guò)的接種環(huán)蘸取組織內(nèi)部液體分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和血瓊脂平板培養(yǎng)基，標(biāo)記后分別放置于37℃ 5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，在18h和36h分別觀察培養(yǎng)基中是否有菌落出現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)基在不同時(shí)間內(nèi)均未出現(xiàn)菌落，提示豬群發(fā)病不是由細(xì)菌感染所致。

3.2 血清學(xué)診斷

靜脈采集發(fā)病豬群和假定健康豬群血液，樣品數(shù)量各10份，共20份，將血液樣品低速(8000r/min)離心5min，取上清備用。使用美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn)的偽狂犬病毒gE抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)20份血清樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示，假定健康豬群血清樣品中有7份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為70%，發(fā)病豬群10份都為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100%。

3.3 病原檢測(cè)與分析

采集病豬腦部和淋巴結(jié)等病變組織，取適量組織與滅菌PBS混合，勻漿，高速離心15min，用DNA/RNA提取試劑盒提取組織上清基因組，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)不同特異性引物分別檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)、豬藍(lán)耳病毒(PRRSV)和PRV(gE基因)。結(jié)果：3份組織樣品均含有PRV核酸(見(jiàn)圖1)，但未檢出其他病原。

M.DL 2 000 marker；P.陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照；1-3.被檢樣品。

3.4 豬偽狂犬病毒gE基因序列擴(kuò)增與分析

隨機(jī)選擇一份PRV陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物送至測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序，對(duì)返回的序列進(jìn)行拼接后，從NCBI下載部分PRV國(guó)內(nèi)流行毒株gE基因序列，并用DNAstar軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)和分析。序列分析結(jié)果：本研究獲得的PRV(Hunan YY)分離株gE基因部分序列長(zhǎng)度為482bp，與中國(guó)流行變異毒株序列相似性為98.5%～99.9%，其中與湖南懷化分離株(PRV-HNHH)和江蘇分離株(PRV-JS2012)的相似性為99.9%(圖2)。分析結(jié)果表明疫情發(fā)生由PRV變異株感染所致。

圖2 PRV gE基因部分序列同源性分析結(jié)果

4 討論

偽狂犬病為高致病性傳染病之一，其中豬為該病的易感動(dòng)物，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大[5]。PRV可感染各發(fā)育階段豬群，仔豬感染該病臨床表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀、嘔吐和腹瀉等，并出現(xiàn)高死亡率；而育肥豬患病則出現(xiàn)呼吸癥狀和生長(zhǎng)遲緩等，不易被養(yǎng)殖戶察覺(jué)；種豬感染該病則導(dǎo)致不孕不育或流產(chǎn)死胎等，給豬場(chǎng)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。近年來(lái)，很多研究報(bào)道免疫接種偽狂犬病毒Bartha株弱毒疫苗的豬場(chǎng)仍然會(huì)發(fā)生PR，提示傳統(tǒng)的疫苗無(wú)法對(duì)豬群提供充分的保護(hù)。因此，免疫接種根據(jù)國(guó)內(nèi)PRV流行株設(shè)計(jì)或制備的疫苗成為防控PR發(fā)生的主要途徑之一[7]。為了確定耒陽(yáng)市某散養(yǎng)豬場(chǎng)仔豬發(fā)病原因，依據(jù)病豬臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，確定為PRV野毒感染所致。通過(guò)對(duì)該毒株gE基因部分序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序與分析，發(fā)現(xiàn)該毒株與PRV中國(guó)流行變異株的gE基因核苷酸序列同源性高達(dá)98.5%～99.9%，可確定該病為PRV變異株感染所引起。

基于以上結(jié)果，采取以下措施：對(duì)發(fā)病嚴(yán)重的豬群進(jìn)行撲殺與無(wú)害化處理，對(duì)發(fā)病較輕或假定健康豬群緊急免疫PRV弱毒疫苗，同時(shí)在飼料中添加適量的恩諾沙星和黃芪多糖；對(duì)豬場(chǎng)用甲醛進(jìn)行熏蒸消毒后徹底打掃，每周消毒2次。通過(guò)以上治療和防控措施的實(shí)施，疫情得到有效控制。

近年來(lái)，湖南省養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展迅速，但仍然存在很多散養(yǎng)戶因其養(yǎng)殖模式相對(duì)落后，部分豬場(chǎng)仔豬靠外購(gòu)后進(jìn)行飼養(yǎng)育肥。本次案例發(fā)生原因也是如此，養(yǎng)殖戶對(duì)購(gòu)入仔豬免疫情況不了解，且未對(duì)豬群及時(shí)免疫接種相應(yīng)疫苗。此外，豬場(chǎng)飼養(yǎng)管理水平低下也是主要原因之一。