朱麗華，王超，宋建領(lǐng)

(1.玉龍縣龍?bào)脆l(xiāng)畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，云南 玉龍 674112；2.玉溪市紅塔區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 玉溪 653100；3.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

養(yǎng)雞場呼吸道和消化道疫病是春季最為常見雞病，尤其是飼養(yǎng)環(huán)境差、飼養(yǎng)密度高的土雜雞場易發(fā)生呼吸道和消化系統(tǒng)疫病。2020年4月份，云南省昆明市某養(yǎng)雞專業(yè)合作社飼養(yǎng)的土雜雞，出現(xiàn)以呼吸系統(tǒng)為主要臨床癥狀的疫病，剖檢發(fā)現(xiàn)部分雞出現(xiàn)肝臟腫大和心包積液。為了解該養(yǎng)雞專業(yè)合作社主要疫病流行情況，結(jié)合臨床獸醫(yī)懷疑疫病情況，對(duì)該養(yǎng)雞專業(yè)合作社的9戶農(nóng)戶養(yǎng)殖的雞采集樣品，進(jìn)行新城疫、禽流感、傳染性喉氣管炎和安卡拉病原檢測，現(xiàn)將檢測結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 病料

2020年4月在云南省昆明市某養(yǎng)雞專業(yè)合作社采集9戶(每戶分別采集5只發(fā)病雞)雞喉氣管、肺臟、脾臟、肝臟等組織樣品，冷藏送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2 主要試劑

RNA/DNA核酸提取試劑盒、RT-PCR 試劑盒、PCR 試劑盒和 DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)等均購自大連寶生物公司。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(型號(hào)為LA2-4A1)，購自ESCO公司；PCR儀(型號(hào)為9700)，購自美國ABI(Applied Biosystems Inc)公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)為2000)，購自美國伯樂BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 病料處理

將每戶采集的組織樣品混合剪碎，按1:5的比例加入滅菌PBS研磨，研磨的混合物反復(fù)凍融3次，3000r/min離心10min；取上清液提取核酸。

2.2 DNA的提取

按照RNA/DNA核酸提取試劑盒說明書，分別提取上清液的RNA/DNA核酸。

2.3 引物合成

根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的禽流感病毒基因序列、新城疫病毒基因序列、傳染性喉氣管炎病毒基因序列和安卡拉病毒基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)[1-4]，合成檢測引物NA/NB、M1F/M1R、ILTF/ILTR和FAdVF/FAdVR，詳細(xì)情況見表1。

2.4 病原核酸檢測

病毒通過RT-PCR、PCR方法分別檢測新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒和安卡拉病毒核酸。新城疫、禽流感檢測反應(yīng)總體積為20μL：2×1 Step Buffer 10 μL，RNase Free ddH2O 6.2 μL，Enzyme Mix 0.8 μL，上游引物(20 pmol/5μL)0.5 μL，下游引物(20 pmol/5μL)0.5 μL，模板RNA 2 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min， 94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7min。傳染性喉氣管炎、安卡拉檢測反應(yīng)總體積為20 μL：Premix TaqTM 10 μL，ddH2O 7 μL，上游引物(20 pmol/5μL)0.5 μL，下游引物(20 pmol/5μL)0.5 μL，模板DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。1.2%瓊脂糖凝膠，100 V電泳30min，觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

表1 PCR、RT-PCR引物序列

3 結(jié)果

3.1 新城疫檢測結(jié)果

9戶發(fā)病雞樣品新城疫病原核酸檢測結(jié)果均為陰性(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.新城疫陽性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3-11.樣品新城疫核酸陰性。

3.2 禽流感檢測結(jié)果

9戶發(fā)病雞樣品禽流感病原核酸檢測結(jié)果均為陰性(圖2)。

M.DL 2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-9.樣品禽流感核酸陰性；10.陰性對(duì)照；11.禽流感陽性樣品。

3.3 安卡拉檢測結(jié)果

9戶發(fā)病雞樣品安卡拉病原核酸陽性2份，安卡拉病原核酸陰性7份(圖3)。

3.4 傳染性喉氣管炎檢測結(jié)果

9戶發(fā)病雞樣品傳染性喉氣管炎病原核酸陽性6份，傳染性喉氣管炎病原核酸陰性3份(圖4)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.安卡拉陽性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3-4.樣品安卡拉核酸陽性；5-11.樣品安卡拉核酸陰性。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1.傳染性喉氣管炎陽性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3-7.樣品傳染性喉氣管炎核酸陽性；8.樣品傳染性喉氣管炎核酸陰性；9.樣品傳染性喉氣管炎核酸陽性；10-11.樣品傳染性喉氣管炎核酸陰性。

3.5 病原核酸檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

9戶發(fā)病雞樣品中，新城疫、禽流感、傳染性喉氣管炎和安卡拉病原檢測結(jié)果表明，9戶發(fā)病雞樣品中，傳染性喉氣管炎病原核酸陽性6戶，陽性率為66.7%，安卡拉病原核酸陽性2戶，陽性率為22.2%，安卡拉病原核酸陽性樣品同時(shí)傳染性喉氣管炎病原核酸也是陽性。

4 討論

養(yǎng)雞專業(yè)合作社的規(guī)范和健康發(fā)展，對(duì)農(nóng)民增收、農(nóng)村穩(wěn)定以及社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展具有較大的影響。但是很多養(yǎng)雞專業(yè)合作社存在飼養(yǎng)密度過大、疫病防控不夠科學(xué)規(guī)范[5]，導(dǎo)致部分養(yǎng)殖戶雞病不能很好控制。在云南由于養(yǎng)雞專業(yè)合作社的養(yǎng)雞戶分布不同的村莊，村莊與村莊距離也較遠(yuǎn)，各村莊的自然環(huán)境和氣候條件存在較大差異，在雞病防控上也不能完全同步進(jìn)行，導(dǎo)致養(yǎng)雞專業(yè)合作社的不同養(yǎng)殖戶發(fā)病情況存在較大差異。本次檢測的一個(gè)養(yǎng)雞專業(yè)合作社的9個(gè)養(yǎng)殖戶，病原檢測結(jié)果存在傳染性喉氣管炎和安卡拉混合感染、傳染性喉氣管炎感染、病原核酸陰性三種方式，雖然同為一個(gè)養(yǎng)雞專業(yè)合作社，但是不同養(yǎng)雞戶的防控措施應(yīng)該根據(jù)檢測結(jié)果，制定個(gè)性化的防控措施才能獲得比較好的防控效果。在養(yǎng)雞密度越來越大的背景下，不論日齡大小表現(xiàn)呼吸道癥狀的疾病最為常發(fā)，除了疫病因素外，提示養(yǎng)雞戶應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和環(huán)境控制，才能很好的防控雞場主要疫病的發(fā)生，與王建聶等報(bào)道云南省土雜雞呼吸系統(tǒng)疫病病因分析結(jié)果一致。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和疫苗質(zhì)量的提高，近幾年來在大劑量和高頻率使用新城疫和禽流感疫苗免疫的情況下，該病的發(fā)生和流行很少[6，7],本次對(duì)該養(yǎng)雞專業(yè)合作社雞病監(jiān)測也未檢測到新城疫和禽流感病原核酸陽性。傳染性喉氣管炎是由傳染性喉氣管炎病毒引起雞的一種急性呼吸道傳染病，該病1925年在美國首次發(fā)現(xiàn)[8]，隨后在世界各地都有發(fā)生，主要表現(xiàn)為呼吸困難、咳出帶有血液的分泌物，喉頭和氣管被堵塞等癥狀[9]，沒有有效藥物治療，給養(yǎng)殖場造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本次檢測結(jié)果證明該養(yǎng)雞專業(yè)合作社主要以傳染性喉氣管炎為主要感染病原，通過傳染性喉氣管炎疫苗緊急免疫，減少了該養(yǎng)雞專業(yè)合作社疫病的發(fā)生率。禽腺病毒(fowl adenovirus, FAdV)4 型為禽腺病毒中致病性最強(qiáng)的[10]，是引起近年來在我國暴發(fā)的以心包積液和肝炎為主要特征的病毒性傳染病主要病原，給我國的養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因?yàn)?987年巴基斯坦的安卡拉地區(qū)首次暴發(fā)該病，所以通俗稱為安卡拉病。1989年后該病在世界范圍內(nèi)流行，2013年在我國散在發(fā)生[11]，2015年在我國大面積暴發(fā)[12-14]，2016年本實(shí)驗(yàn)室在云南省石林縣肉雞群首次檢測到安卡拉病原核酸后，每年都能在云南雞群中檢測到安卡拉病原核酸陽性樣品，本次檢測樣品中安卡拉病原核酸陽性率為22.2%，說明安卡拉病仍然在該養(yǎng)雞專業(yè)合作社存在，在防控雞傳染性喉氣管炎感染的同時(shí)，也要加強(qiáng)雞安卡拉病的防控。