劉利樂，張靜，吳敏,陳柯*

(1 中南民族大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，武漢 430074；2武漢凱迪電力環(huán)保有限公司，武漢 430074)

重金屬鉛(Pb)是自然界中廣泛分布的有毒金屬，由于其不可進(jìn)行生物降解，在環(huán)境中穩(wěn)定存在，引發(fā)了許多環(huán)境污染問題，植物修復(fù)環(huán)境友好且成本低，是修復(fù)鉛污染的良好選擇[1].植物中重金屬產(chǎn)生的影響包含影響植物種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育、活性氧(ROS)的積累等.

高羊茅是一種多年生草本植物，其根系發(fā)達(dá)、具有纖維根且對(duì)環(huán)境適應(yīng)性廣適應(yīng)性強(qiáng)，多見于園林綠化和護(hù)坡植被，現(xiàn)在生態(tài)修復(fù)方面廣泛應(yīng)用.據(jù)報(bào)道，高羊茅已經(jīng)表現(xiàn)出了對(duì)Cu、Cd、Pb、Zn等各種重金屬的抗性，在植物修復(fù)方面表現(xiàn)出了遠(yuǎn)大的應(yīng)用前景[2].

一氧化氮(NO)作為在生物體內(nèi)廣泛分布的水溶性和脂溶性氣體小分子信號(hào)物質(zhì)，在細(xì)胞水溶液部分和細(xì)胞膜的脂相間自由穿梭，參與動(dòng)植物重要的生理過程，對(duì)植物而言NO主要影響種子萌發(fā)、生長發(fā)育、光合作用、根系生長以及抗逆反應(yīng)等.NO的作用是雙重的，低濃度的NO能促進(jìn)植物生長發(fā)育和提高植物的抗逆性，主要體現(xiàn)在NO的抗氧化性，減輕超氧陰離子毒害作用；高濃度NO不僅會(huì)抑制植物的生長發(fā)育，還會(huì)造成DNA損傷，甚至細(xì)胞死亡[3].NO能夠擁有以上功能并參與生理調(diào)節(jié)，由于它與生物體內(nèi)的眾多信號(hào)途徑密切相關(guān)，包括活性氧、茉莉酸、水楊酸和Ca2+途徑等[4].硝普鈉(SNP)是一種常用的外源一氧化氮供體，0.5 mmol的SNP約可產(chǎn)生0.2 μmol NO.施加外源SNP，可改善辣椒植株葉片和根的生理狀況，提高抗氧化酶活性，有助于適應(yīng)環(huán)境，還可提高干旱脅迫下紫花苜蓿的抗氧化酶活性等[5].因此，本文在已知高羊茅對(duì)重金屬有耐性的前提下，通過外源添加NO,改善在鉛脅迫下高羊茅的生理狀況，減弱鉛對(duì)高羊茅的損害，增加對(duì)鉛的吸收并達(dá)到提高高羊茅修復(fù)效果的目的.

1 材料與方法

1.1 樣品、試劑和儀器

選擇“獵狗五號(hào)”高羊茅種子，播種于方形塑料盆中，以蛭石和珍珠巖作為培養(yǎng)基質(zhì)，體積比為1∶1清水澆灌.待種子萌發(fā)并長出5 cm后，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室培育，每天光照16 h，光照強(qiáng)度為300 μmol/(m2·s)，室溫控制在23～26 ℃，持續(xù)2個(gè)月.

硝酸鉛(Sinopharm)；硝普鈉(Sigma)；酶活性試劑盒(南京建成生物工程研究所)；3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB，Sigma-Aldrich)；超氧自由基染色劑氮藍(lán)四唑(NBT，Sigma-Aldrich).手持式葉綠素?zé)晒鈨x(SPAD-502,Minolta,Osaka，Japan)；紫外分光光度計(jì)(MAPADA)；火焰原子吸收光譜儀(AA-7001F,East & West Analytical Instrument)；便攜式脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x(PAM 2500,Heinz Walz GmbH)；根拓?fù)鋻呙?WINRHIZO,Regent Instruments Inc.,Canada).

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將發(fā)芽2個(gè)月的高羊茅轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，用改良1/2 Hoagland營養(yǎng)液水培，其中使用氯化鉀代替磷酸二氫鉀，并通過氫氧化鉀調(diào)節(jié)營養(yǎng)液中的pH值，調(diào)整范圍為5.8～6.2，適應(yīng)環(huán)境1周.隨后用硝酸鉛和硝普鈉(SNP)進(jìn)行處理，設(shè)置以下2個(gè)處理組：(1)對(duì)照組200 mg·L-1Pb2+(200Pb)；(2)200 mg·L-1Pb2++200 μmol SNP(200PbS)，每個(gè)處理組設(shè)置4個(gè)重復(fù).每隔1 d補(bǔ)充營養(yǎng)液，每隔2 d更換新的營養(yǎng)液，持續(xù)2周.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生物量和葉片葉綠素含量測定

在將高羊茅轉(zhuǎn)為水培適應(yīng)1周后，除去枯黃衰老的葉片，減去多余的葉片部分，只留10 cm高，調(diào)整高羊茅的重量(重量誤差不超過10%)，并記錄.用Pb2+和SNP處理2周后，優(yōu)先測定每瓶高羊茅的重量，即為最終生物量，用鮮重表示.

高羊茅在Pb2+和SNP的環(huán)境中處理2周后，可用手持式葉綠素?zé)晒鈨x原位測定其葉綠素含量，每瓶測8個(gè)重復(fù).

1.3.2 高羊茅根和葉中Pb2+含量測定

先將高羊茅的根和葉用10 mmol·L-1EDTA浸泡2次，每次10 min，再用蒸餾水洗滌3次，置于烘箱中，并在60 ℃下烘烤至恒重.然后將高羊茅的葉和根單獨(dú)切割并稱重，分別取0.2 g放入消解罐中，加入2 mL H2O2和6 mL HNO3，在微波消解器中消解10 min，結(jié)束后用火焰原子吸收光譜儀測定其中Pb2+濃度.

1.3.3 酶活性測定

取0.1 g高羊茅的組織分別置于2 mL離心管中，加入2個(gè)直徑為3 mm的鋼球并在液氮中快速冷凍，用破碎機(jī)粉碎植物組織.再加入0.9 mL 在4 ℃下預(yù)冷凍的pH=7.8的磷酸緩沖溶液，以3500 r·min-1在4 ℃離心20 min，取上清液備用.根據(jù)SOD、POD和APX的酶活性試劑盒的說明進(jìn)行紫外分光光度計(jì)測定.

1.3.4 脂質(zhì)過氧化

通過對(duì)ALZAHRANI和RADY描述的方法稍作修改后測定丙二醛(MDA)的含量[6].將新鮮植物組織破碎后加入緩沖溶液離心后可取上清液待測.

1.3.5 葉片電導(dǎo)率測定

取0.1 g高羊茅葉片，用蒸餾水洗凈后，放入試管中，加入15 mL蒸餾水，室溫下振蕩24 h即可用電導(dǎo)率儀測量初始電導(dǎo)率.將試管于121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻至室溫后，可確定其最終電導(dǎo)率.

分別用DAB和NBT測定高羊茅葉片中過氧化氫和超氧陰離子的含量.取0.5 g葉子浸入DAB溶液中并在真空中染色30 min，再將染色的葉子轉(zhuǎn)移到乙酸-甘油-乙醇(體積比1∶1∶3)溶液中.在100 ℃水浴5 min，再將葉子置于甘油-乙醇(體積比1∶4)中30 min，最后，用液氮將染色后的葉片研磨成粉狀，混入0.2 mol·L-1HClO4，以12000 g在37 ℃下離心10 min.取上清液在450 nm處測量吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2O2的濃度.

1.3.7 快速葉綠素(Chl)熒光瞬態(tài)和熒光動(dòng)力學(xué)曲線的測定

通過便攜式脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行葉綠素?zé)晒馑矐B(tài)曲線和慢速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)的測量.

1.3.8 根系形態(tài)分析

高羊茅根系形態(tài)的分析可通過自動(dòng)化根拓?fù)鋻呙柩b置來確定.使用WINRHIZO掃描進(jìn)行分析，從分析的結(jié)果中可獲得根的總長度(RL)、根投影面積(PA)、根表面積(RS)、根平均直徑(AD)、根體積(RV)和根尖數(shù)(RTS)的數(shù)據(jù).

1.3.9 根細(xì)胞壁制取及多糖分析

取0.1 g新生根尖，破碎后與1.5 mL 80%乙醇混合后，置冰中30 min，用1.5 mL 80%乙醇清洗沉淀，去掉上清液.分別用1.5 mL經(jīng)預(yù)冷凍的丙酮、甲醇-氯仿(體積比1∶1)混合物、甲醇洗滌，去掉上清液，冷凍干燥，即可得到粗細(xì)胞壁.細(xì)胞壁的分級(jí)提取.

果膠：用0.75 mL 含有0.1% NaBH4(pH 4)的0.5%草酸銨緩沖液在沸水浴中提取2次干燥的粗細(xì)胞壁材料各1 h，離心，收集上清液得到果膠組分.

HCl：在室溫下用0.5 mL含有0.1% NaBH4的4% KOH分別對(duì)沉淀萃取3次，總時(shí)間為24 h.離心，收集上清液得到HCl組分，再用冰醋酸中和.

HC2：在室溫下用0.5 mL含有0.1% NaBH4的24% KOH分別對(duì)沉淀萃取3次，總時(shí)間為24 h.離心，收集上清液得到HC2組分，再用冰醋酸中和.

纖維素：將24% KOH萃取后的沉淀凍干，稱重并討論纖維素組分.

細(xì)胞壁組分中的多糖含量用中性糖和糖醛酸來表示，其中Pectin、HC1和HC2中的中性糖用苯酚-硫酸法檢測，糖醛酸用間羥基聯(lián)苯法檢測，而纖維素的中性糖含量檢測需要先預(yù)處理，用4 mL 2 mol·L-1的硫酸在95 ℃下水解沉淀2 h后離心，取上清液，殘?jiān)脽崴礈?次后與上清液混合，定容至100 mL，再按苯酚-硫酸法測定，各細(xì)胞壁組分含量均以鮮重表示.

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對(duì)鉛脅迫下高羊茅生物量、葉綠素含量和Pb2+吸收的影響

高羊茅在受到Pb2+脅迫后會(huì)出現(xiàn)長勢變差，生物量逐漸下降等反應(yīng)，而外源添加了SNP后，能夠緩解Pb2+的抑制現(xiàn)象.由圖1可見：分別用Pb2+和SNP處理14 d后，與對(duì)照組200Pb相比，200PbS條件下高羊茅的生物量和葉綠素含量出現(xiàn)明顯提高，分別增加了15.4%和11.1%.由于NO可直接作用于細(xì)胞壁，使其結(jié)構(gòu)變得松散，或者作用于細(xì)胞膜，增強(qiáng)其流動(dòng)性功能，使得細(xì)胞得到擴(kuò)展[7].

圖1 硝普鈉對(duì)鉛脅迫下高羊茅生物量和葉綠素含量的影響

相一致的，對(duì)于Pb2+的吸收來說，由表1可知:在200PbS脅迫的根中Pb2+的積累量與200Pb存在微量差別，但是葉片中200PbS Pb2+含量比200Pb少9.4%，并且向葉片的轉(zhuǎn)移量更少，這說明經(jīng)SNP處理后，Pb2+主要被保存在了根中，減少葉中的Pb2+含量.

表1 鉛在高羊茅根和葉中的積累

2.2 外源NO對(duì)鉛脅迫下高羊茅抗氧化酶的影響

植物能夠正常的生長發(fā)育，是因?yàn)槠鋬?nèi)部各個(gè)生理過程的氧化還原環(huán)境處于平衡狀態(tài)，這得益于其自身的抗氧化酶系統(tǒng)，SOD能清除植物細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子自由基，POD和APX能夠?qū)⑸矬w內(nèi)的積累H2O2分解為水和氧氣，減弱H2O2對(duì)其的毒害作用.但當(dāng)受到脅迫時(shí)會(huì)打破這個(gè)平衡，使各個(gè)酶活性受到抑制，導(dǎo)致過量的活性氧對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用[8]，甚至造成植株死亡,NO作為外界脅迫下的抗氧化劑，對(duì)植物細(xì)胞起保護(hù)作用，可直接清除活性氧[9].外源NO對(duì)鉛脅迫下高羊茅抗氧化酶的影響結(jié)果見圖2,圖2中高羊茅的SOD、POD和APX的活性，無論在是根還是葉中，200PbS處理的組分，均高于200Pb的活性，葉的抗氧化物酶活性均高于根，其中200PbS葉片中APX的活性比根高234.9%.NO提高了植物的抗氧化性，相關(guān)抗氧化酶SOD、POD、APX的活性也有所改善.

圖2 硝普鈉對(duì)鉛脅迫下高羊茅根和葉中超氧化物歧化酶(A)、過氧化物酶(B)、丙二醛水平(C)和抗壞血酸過氧化物酶(D)活性的影響

2.3 外源NO對(duì)鉛脅迫下高羊茅活性氧含量、脂質(zhì)過氧化和電導(dǎo)率的影響

圖3 硝普鈉對(duì)鉛脅迫下高羊茅葉片電導(dǎo)率的影響

圖4 硝普鈉對(duì)鉛脅迫下高羊茅葉片中活性氧含量的影響

2.4 外源NO對(duì)鉛脅迫下高羊茅光合作用的影響

高羊茅作為一種普通的綠色植物，其生長和繁殖的主要能量來自光合作用，而葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的必需物質(zhì)，決定著植物的光合速率，圖1中SNP增加了高羊茅Chl的水平，說明一定濃度的NO能促進(jìn)植物葉片中Chl的合成[11].除此之外，NO還能緩解Pb2+引起的光抑制,200PbS比200Pb的初始熒光值低，說明200PbS的PSII反應(yīng)中心受到的抑制更小(圖5、圖6、表2)，即Pb2+的光抑制現(xiàn)象減弱[12].圖6顯示，在Pb2+和SNP處理2周后，高羊茅葉片出現(xiàn)了明顯的K-band和L-band，說明在反應(yīng)過程中電子傳遞收到阻礙，而200PbS的影響程度更低，SNP有效緩解了這種抑制.

圖5 硝普鈉對(duì)鉛脅迫下高羊茅葉片OJIP瞬態(tài)曲線的影響

A表示OJIP瞬態(tài)曲線上從O點(diǎn)到K點(diǎn)的熒光值，Wok=(Ft﹣Fo)/(Fk﹣Fo)；B表示O點(diǎn)到K點(diǎn)間200Pb與200PbS熒光值的差值，ΔWok

表2 從OJIP曲線得到的光合作用基本熒光參數(shù)

在Pb2+處理下，會(huì)使得天線色素吸收的光能更多的用于熱耗散，而減少光化學(xué)反應(yīng)的量[13],但經(jīng)SNP處理后，出現(xiàn)了相反的變化，從表3可知，和對(duì)照組200Pb相比，200PbS處理組φP0、ψE0、γRC和PIABS都出現(xiàn)上升趨勢，其中PIABS增加了15.8%，而δR0和PItotal分別下降了15.9%和10.3%.在表4中，200PbS處理組的非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ、qN)都表現(xiàn)為下降，光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP、qL)都表現(xiàn)為上升，說明NO有利于植物光合作用過程(表4).

表3 通過JIP-test分析OJIP熒光瞬態(tài)曲線所得光合作用參數(shù)

表4 通過慢速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線得到的光合作用參數(shù)

2.5 外源NO對(duì)鉛脅迫下高羊茅根系結(jié)構(gòu)及組分的影響

根系在植物的生長發(fā)育過程中起重要作用，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)均能反映受脅迫程度的大小，也是高羊茅吸取營養(yǎng)液的直接器官，是直接與Pb2+和SNP接觸的部分，能夠快速反映出植株的真實(shí)狀況.表5直觀地展示了高羊茅根結(jié)構(gòu)的狀況(RL、PA、RS、AD、RV和RTS)，NO增加了高羊茅根系的生物量和比表面積，減少了根尖數(shù)，由于Pb2+引起根尖分裂受阻,影響了根的正常生理過程，導(dǎo)致根系生長受阻，而NO通過減少對(duì)Pb2+的吸收，減輕了Pb2+對(duì)根系的破壞(表1).

表5 高羊茅根系數(shù)據(jù)(總根長、根投影面積、根表面積、根平均直徑、根體積和根尖數(shù))

細(xì)胞壁是響應(yīng)金屬脅迫的功能信號(hào)分子和代謝所在的位點(diǎn)，骨架主要由果膠、HC1、HC2和纖維素構(gòu)成.植物應(yīng)對(duì)Pb2+脅迫的防御策略主要是通過細(xì)胞壁增厚.由圖7可見：在根細(xì)胞壁中，200Pb的各個(gè)組分(果膠、HC1、HC2和纖維素)的含量、中性糖和糖醛酸的總量均比200PbS高，中性糖和糖醛酸的總量各高22.7%和42.9%.經(jīng)Pb2+處理后，高羊茅根系的多糖總量(中性糖和糖醛酸的和)增加，形成了Pb2+的額外積累空間，為其在植物的吸收提供了基礎(chǔ)[14].糖醛酸作為細(xì)胞壁中吸附 Pb2+主要部位，果膠中200Pb的糖醛酸與中性糖的比值也比200PbS高33.3%.而NO可以抑制細(xì)胞壁增厚的進(jìn)程，減少細(xì)胞壁中Pb2+的結(jié)合位點(diǎn)，阻止Pb2+通過細(xì)胞壁和減少滲入原生質(zhì)體的Pb2+的量(圖7)，預(yù)防引起ROS的過量積累(圖4)，維持氧化還原平衡和正常生物代謝[15].

圖7 硝普鈉對(duì)鉛脅迫下高羊茅根細(xì)胞壁中性糖(A)、糖醛酸(B)及它們比例(C)的影響

3 結(jié)論

外源一氧化氮緩解鉛對(duì)高羊茅的脅迫作用的機(jī)理在于：

(2)NO提高了抗氧化酶(SOD、POD、APX)的活性，維持植物體內(nèi)的氧化還原平衡，降低脂質(zhì)過氧化對(duì)細(xì)胞膜的破壞，抑制氧化損傷.

(3)NO重塑高羊茅根系的結(jié)構(gòu)和組成，減少細(xì)胞壁中Pb2+的附著位點(diǎn)，特別是減少Pb2+向葉片的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)葉綠素的合成，保證光合作用的正常運(yùn)行，使其能為高羊茅的生長發(fā)育提供充足的營養(yǎng).