黃瑛,殷劍波,李小連,賈彬,黃敏
(1深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳市海藻生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室,廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳大學(xué) 生命科學(xué)與海洋學(xué)院,深圳518060;2中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,武漢 430074)
微藻通過(guò)光照自養(yǎng)和異養(yǎng)方式生產(chǎn)高價(jià)值生物活性化合物,包括色素、脂類和類胡蘿卜素等,其衍生物在功能性食物、動(dòng)物飼料、藥物、化學(xué)原料及生物燃料等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力[1].隨著合成生物學(xué)興起,多基因共調(diào)控技術(shù)在微藻脂質(zhì)合成中發(fā)揮著日益重要的功能,成為突破藻類產(chǎn)油瓶頸,開發(fā)穩(wěn)定高效產(chǎn)脂工程株的關(guān)鍵.通過(guò)脂質(zhì)合成與代謝機(jī)制的多通路共同優(yōu)化,引導(dǎo)碳流量流向脂質(zhì)合成途徑具有廣闊的應(yīng)用前景.
提高油脂積累可以通過(guò)多種策略來(lái)實(shí)現(xiàn).增加脂肪酸合成前體乙酰輔酶A含量或提高NADPH的還原力;通過(guò)降低CIS活性[2]或磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶活性(PEPC)[3]可引導(dǎo)更多的碳流量流向脂肪酸合成.降低LACS[4]的活性,可以減少脂肪酸的氧化積累脂肪酸.過(guò)表達(dá)乙酰輔酶A羧化酶(ACAC)[5]或者?;ワ柡兔?FAD)[6]等也可以增加脂肪酸的合成.轉(zhuǎn)錄因子控制多種酶的活性,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)和生長(zhǎng),影響著脂質(zhì)的合成.過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子DOF[7]或bZIP[8],可以影響脂肪酸合成的相關(guān)基因,例如ACAC和LACS等,因此轉(zhuǎn)錄因子可作為全局調(diào)節(jié)因子,調(diào)節(jié)微藻細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)并影響脂質(zhì)合成與代謝途徑.
使用模式生物萊茵衣藻作為多基因調(diào)控積累油脂的研究對(duì)象,通過(guò)在衣藻中進(jìn)行RNAi干擾抑制CIS和LACS,從而改變碳通量和減少脂肪酸氧化;同時(shí)過(guò)表達(dá)內(nèi)源性DOF轉(zhuǎn)錄因子,增加脂肪酸合成,實(shí)現(xiàn)多基因共調(diào)控.本研究分析了多基因共調(diào)控的微藻生長(zhǎng)及油脂積累等生理生化的變化,為高產(chǎn)油脂藻株的構(gòu)建提供參考.
萊茵衣藻cc849,萊茵衣藻DOF工程藻來(lái)源于深圳海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù),萊茵衣藻DOF工程藻含有熱激啟動(dòng)子HSP70A-RBCS2,可過(guò)表達(dá)DOF基因.載體PMAA7IR來(lái)源于深圳海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,載體PMAA7IR包含啟動(dòng)子RBCS2、用于5-FI篩選的MAA7 基因、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和潮霉素基因.
培養(yǎng)基采用TAP培養(yǎng)基.初始接種細(xì)胞濃度5×104個(gè)/mL,光照強(qiáng)度60 μmol/m2·s.熱激條件為藻株生長(zhǎng)至第4 d水浴40 ℃ 30 min后正常培養(yǎng).
1.3.1 載體的構(gòu)建
引物序物列如表1.分別以引物1擴(kuò)增萊茵衣藻CIS的3′UTR片段,以引物2擴(kuò)增萊茵衣藻LACS的3′UTR片段;分別以擴(kuò)增片段CIS和LACS為模板,引物3擴(kuò)增CIS反向互補(bǔ)片段,以引物4擴(kuò)增LACS反向互補(bǔ)片段.間隔序列sp片段則由引物5擴(kuò)增.連接后插入pMaa7IR載體,獲得PMAA7IR/LACS2-CIS1 IR沉默載體.擴(kuò)增程序如下:(1)95 ℃,3 min;(2)94 ℃,30 s;(3)60 ℃,30 s;(4)72 ℃,50 s;(2)~(4)30個(gè)循環(huán);(5)72℃,5 min.
表1 用于擴(kuò)增PCR引物
1.3.2 萊茵衣藻轉(zhuǎn)化
將PMAA7IR/LACS2-CIS1 IR沉默載體利用珠磨法轉(zhuǎn)入DOF工程藻.轉(zhuǎn)化后藻株轉(zhuǎn)移至50 mL無(wú)菌離心管,并在弱光25 ℃、100 r/min培養(yǎng)過(guò)夜.5000 r/min離心5 min收集藻細(xì)胞.涂于色氨酸、潮霉素和5-FI的 TAP固體平板,平板倒置于25 ℃,光照60 μmol/m2·s培養(yǎng).
取對(duì)數(shù)期細(xì)胞,0.01 M PBS緩沖液洗兩遍,吸取980 μL稀釋藻液轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管,加入20 μL的BODIPY505/515染液.BD FACSCalibur流式分析儀,選取FITC通道,讀數(shù)10000個(gè)細(xì)胞,每個(gè)樣重復(fù)3次.
藻粉10 mg置于15 mL玻璃管,加入2 M NaOH-CH3OH溶液反應(yīng),再加入4 M HCl-CH3OH溶液,正己烷萃取后氮吹儀吹干.500 μL CH2Cl2懸浮,并轉(zhuǎn)移至色譜進(jìn)樣瓶中,上機(jī)檢測(cè).GC-MS氣相色譜柱為VF-23 MS,柱子規(guī)格為30.0 m×320 μm×0.25 μm,最高溫度為260 ℃.進(jìn)樣口溫度為250 ℃,采用分流進(jìn)樣模式,分流比為10∶1,載氣為高純He.柱溫箱升溫程序:(1)70 ℃,4 min;(2)25 ℃/min速率升溫至195 ℃;(3)3 ℃/min速率升溫至205 ℃;(4)8 ℃/min速率升溫至230 ℃,保持1 min.質(zhì)譜檢測(cè)器選擇全掃描模式,氣相色譜-質(zhì)譜傳輸線溫度為250 ℃.
利用血球計(jì)數(shù)板每隔24 h記錄細(xì)胞數(shù)目測(cè)定生長(zhǎng)曲線.淀粉測(cè)定按照淀粉提取試劑盒(Solarbio)說(shuō)明提取并檢測(cè).蛋白質(zhì)測(cè)定條件為:藻液2 mL離心加入PBS緩沖液沖洗,加入200 μL BugBuster Protein Extraction Reagent(默克)裂解液,水浴在30 °C震蕩反應(yīng)30 min,離心取上清液稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍,酶標(biāo)儀檢測(cè).
按照Trizol說(shuō)明書提取RNA,用PrimeScriptTMRAT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA.按照KOD SYBR qPCR Mix Kit(Toyobo)用于qRT-PCR的檢測(cè).以β-actin為內(nèi)參.其程序?yàn)椋?1)98 ℃ 2min;(2)98 ℃ 10 s,(3)60 ℃ 30 s,(4)72 ℃ 30 s,(2)~(4)40個(gè)循環(huán).
通過(guò)重疊擴(kuò)增PCR法連接LACS2基因的3′UTR片段和CIS1基因3′UTR片段形成串聯(lián)反向重復(fù)序列(圖1),插入至EcoRⅠ限制性酶切位點(diǎn)的沉默載體PMAA7IR,得到重組載體(PMAA7IR/LACS2-CIS1 IR).將重組載體采用珠磨法轉(zhuǎn)入DOF工程藻,在含有濃度為12.5 μg/mL潮霉素和濃度5 μM的5FI的TAP平板篩選三基因工程藻的轉(zhuǎn)化子(圖2a).提取部分轉(zhuǎn)化子的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)基因組驗(yàn)證,顯示PMAA7IR/LACS2-CIS1 IR已成功整合到DOF工程藻株基因組DNA中(圖2b).利用熒光染色法測(cè)定150株三基因工程藻中性脂含量,發(fā)現(xiàn)33株三基因工程藻中性脂含量較野生型cc849高(圖2c).其中工程藻DLC-4、DLC-7 和DLC-8脂質(zhì)含量較高,與野生型cc849相比,工程藻DLC-4脂質(zhì)含量增加了74%(圖2d).分析基因表達(dá)量表明,三基因轉(zhuǎn)化藻株DLC-4和DLC-8中LACS2和CIS1均下調(diào)表達(dá),其中DLC-4與對(duì)照組相比分別下調(diào)表達(dá)58%和26%(圖2e).上述結(jié)果表明,DOF-LACS2-CIS1三基因轉(zhuǎn)化藻株構(gòu)建成功.
(a)重疊PCR合成LACS2-CIS1反向重復(fù)片段;(b)沉默載體PMAA7IR示意圖;(c)重組載體(pMaa7IR/LACS2-CIS1 IR); 箭頭代表引物
(a)工程藻轉(zhuǎn)化株;(b)雙基因LACS2-CIS1和熒光素酶的基因組驗(yàn)證;(c)通過(guò)中性脂篩選轉(zhuǎn)化株;(d)選定的轉(zhuǎn)化株;(e)qRT-PCR驗(yàn)證雙基因LACS2-CIS1的表達(dá)量;*P < 0.05,** P< 0.01,***P<0.001,student t test(n=3)
微藻生物量在生物燃料、高價(jià)值營(yíng)養(yǎng)品等產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)起著很重要的因素.對(duì)比三基因藻株(DLC-4)與cc849(WT)的生長(zhǎng)(圖3a),在8 d的培養(yǎng)期間,2種微藻生長(zhǎng)趨勢(shì)相似,均可以達(dá)到較高細(xì)胞密度1.4×107個(gè)/mL.DLC-4在接種后的第4 d進(jìn)入平臺(tái)期,比WT提前1 d.胞內(nèi)中性脂隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)不斷積累,在對(duì)數(shù)期后期和平臺(tái)期積累的油脂最高(圖3b),DLC-4的中性脂在第5 d以后趨于平穩(wěn),而WT的中性脂在第5 d達(dá)到最大值.對(duì)比培養(yǎng)第6 d藻株的蛋白(圖3c),淀粉(圖3d)以及脂肪酸(圖3e)的含量,發(fā)現(xiàn)與WT相比,DLC-4的蛋白和淀粉含量略微下降,淀粉含量分別為73.64 mg/g和66.90 mg/g;蛋白含量分別為134.29 mg/g和122.99 mg/g;而胞內(nèi)脂肪酸含量上升了31%.這說(shuō)明降低CIS1和LACS2活性引導(dǎo)更多的碳流量流向脂肪酸合成[2]和減少了脂肪酸的氧化[4].
(a)生長(zhǎng)曲線;(b)對(duì)數(shù)后期及平臺(tái)期的中性脂含量;(c)蛋白含量;(d)淀粉含量;(e)脂肪酸含量;*P<0.05,student t test(n=3)
由于DOF工程藻具有熱激啟動(dòng)子,因此藻細(xì)胞正常培養(yǎng)至第4 d熱激誘導(dǎo),第5 d以后2種微藻的生長(zhǎng)均受到影響(圖4a).熱激后的DLC-4(HDLC-4)的中性脂在第6 d最大(圖4b).WT與熱激后的WT(HWT)相比脂肪酸含量無(wú)明顯差異(圖4c).HDLC-4與熱激前比較淀粉含量分別為112.82 mg/g和61.91 mg/g(圖4d),蛋白濃度分別為163.86 mg/g和124.57 mg/g(圖4e),淀粉和蛋白含量下降了45%和24%,而脂肪酸含量上升了52%(圖4f).說(shuō)明在熱激啟動(dòng)作用下,隨著DOF轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá),三基因共調(diào)控的手段可能減少微藻的淀粉和蛋白的含量,為脂肪酸合成提供所需的前體和能量,促進(jìn)脂肪酸含量提高更多.
(a)生長(zhǎng)曲線;(b)對(duì)數(shù)后期及平臺(tái)期中性脂含量;(c)WT 和 HWT脂肪酸含量對(duì)比;(d)HWT 和 HDLC-4淀粉含量對(duì)比;(e)HWT 和 HDLC-4蛋白含量對(duì)比;(f)HWT 和 HDLC-4脂肪酸含量對(duì)比; *P<0.05,**P< 0.01,student t test(n=3)
DOF、LACS2 和CIS1 基因參與細(xì)胞內(nèi)多種代謝活動(dòng),是細(xì)胞內(nèi)代謝途徑的關(guān)鍵酶.小球藻過(guò)表達(dá)大豆DOF基因上調(diào)了長(zhǎng)鏈?;o酶A合成酶和乙酰輔酶A活性增加脂肪酸含量[7].ACS參與細(xì)胞脂肪合成和降解.2016年在衣藻中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)ACS基因[4],其中LACS2與擬南芥參與β-氧化的ACS基因相似[9].通過(guò)反義RNA干擾下調(diào)其活性增加了大量的脂肪酸含量.通過(guò)RNAi干擾CIS基因,發(fā)現(xiàn)碳通量更多的分配從頭合成脂肪酸,并上調(diào)磷脂酸磷酸酯酶(PAP)和二酰甘油?;D(zhuǎn)移酶(DGAT)的活性來(lái)增加TAG的積累[2].本研究對(duì)萊茵衣藻三基因共調(diào)控脂肪酸合成進(jìn)行了分析.結(jié)果顯示,在正常培養(yǎng)條件下,DLC-4脂肪酸含量相比WT提高了31%,生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致,但淀粉和蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著性變化.可能是下調(diào)的CIS1 和LACS2 基因分別發(fā)揮基因功能,引導(dǎo)更多的碳流量用于脂肪酸合成及減少了脂肪酸氧化.
在熱激誘導(dǎo)條件下,HSP70A-RBCS2啟動(dòng)子驅(qū)使DOF轉(zhuǎn)錄因子高表達(dá).WT與HWT相比脂肪酸含量無(wú)明顯差異.據(jù)報(bào)道,熱激環(huán)境下可促進(jìn)衣藻的膜脂直接轉(zhuǎn)化為TAG作為儲(chǔ)蓄物質(zhì)而不影響脂肪酸和淀粉含量[10].這也排除了熱激作為外界環(huán)境影響脂肪酸、淀粉的含量變化的可能.HDLC-4胞內(nèi)總脂肪酸比HWT相比提高了52%,但蛋白和淀粉含量分別下降了24.0%和45%.表明在三基因共調(diào)控下,淀粉和蛋白的減少可能為脂肪酸合成提供所需的前體和能量.
研究表明,過(guò)表達(dá)硅藻雙基因Δ5去飽和酶(PtD5)和丙二酰輔酶A?;d體蛋白轉(zhuǎn)?;?MCAT)基因增加長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸(EPA、ARA、DHA)的含量[11].過(guò)表達(dá)柵藻Scenedesmusquadricauda的三基因,包括乙酰輔酶A羧化酶ACC1、甘油激酶(GPD1)和磷酸甘油脫氫酶(GUT1),與野生型相比油脂顯著增加[12].工程藻DLC-4雖能提高油脂含量,但作為高產(chǎn)油脂藻株應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn),還需要參考更多基因組合,進(jìn)行后續(xù)研究.
通過(guò)將雙基因沉默載體(LACS2-CIS1)轉(zhuǎn)入萊茵衣藻DOF工程藻中,構(gòu)建了萊茵衣藻三基因共調(diào)控藻株.與萊茵衣藻cc849相比,三基因藻株生長(zhǎng)狀態(tài)相似,淀粉和蛋白無(wú)明顯改變,但胞內(nèi)中性脂含量明顯增加,且脂肪酸含量上升了31%.在熱激啟動(dòng)作用下,三基因藻株淀粉和蛋白含量下降了58%和26%,胞內(nèi)中性脂含量增加74%,脂肪酸含量上升了52%.故通過(guò)共調(diào)控三基因DOF-LASC2-CIS1顯著提高了萊茵衣藻的脂質(zhì)含量,也證明了使用多個(gè)基因改造技術(shù)在衣藻工程藻應(yīng)用中具有重要的潛力,這為未來(lái)微藻生物資源利用發(fā)展提供了一個(gè)新思路.