黃瑛，殷劍波，李小連，賈彬，黃敏

(1深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點實驗室，深圳市海藻生物技術(shù)工程實驗室，廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點實驗室，深圳大學(xué) 生命科學(xué)與海洋學(xué)院，深圳518060；2中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，武漢 430074)

微藻通過光照自養(yǎng)和異養(yǎng)方式生產(chǎn)高價值生物活性化合物，包括色素、脂類和類胡蘿卜素等，其衍生物在功能性食物、動物飼料、藥物、化學(xué)原料及生物燃料等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力[1].隨著合成生物學(xué)興起，多基因共調(diào)控技術(shù)在微藻脂質(zhì)合成中發(fā)揮著日益重要的功能，成為突破藻類產(chǎn)油瓶頸，開發(fā)穩(wěn)定高效產(chǎn)脂工程株的關(guān)鍵.通過脂質(zhì)合成與代謝機制的多通路共同優(yōu)化，引導(dǎo)碳流量流向脂質(zhì)合成途徑具有廣闊的應(yīng)用前景.

提高油脂積累可以通過多種策略來實現(xiàn).增加脂肪酸合成前體乙酰輔酶A含量或提高NADPH的還原力；通過降低CIS活性[2]或磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶活性(PEPC)[3]可引導(dǎo)更多的碳流量流向脂肪酸合成.降低LACS[4]的活性，可以減少脂肪酸的氧化積累脂肪酸.過表達乙酰輔酶A羧化酶(ACAC)[5]或者?；ワ柡兔?FAD)[6]等也可以增加脂肪酸的合成.轉(zhuǎn)錄因子控制多種酶的活性，可以調(diào)節(jié)細胞的應(yīng)激反應(yīng)和生長，影響著脂質(zhì)的合成.過表達轉(zhuǎn)錄因子DOF[7]或bZIP[8]，可以影響脂肪酸合成的相關(guān)基因，例如ACAC和LACS等，因此轉(zhuǎn)錄因子可作為全局調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)微藻細胞代謝網(wǎng)絡(luò)并影響脂質(zhì)合成與代謝途徑.

使用模式生物萊茵衣藻作為多基因調(diào)控積累油脂的研究對象，通過在衣藻中進行RNAi干擾抑制CIS和LACS，從而改變碳通量和減少脂肪酸氧化；同時過表達內(nèi)源性DOF轉(zhuǎn)錄因子，增加脂肪酸合成，實現(xiàn)多基因共調(diào)控.本研究分析了多基因共調(diào)控的微藻生長及油脂積累等生理生化的變化，為高產(chǎn)油脂藻株的構(gòu)建提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

萊茵衣藻cc849，萊茵衣藻DOF工程藻來源于深圳海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點實驗室藻種庫，萊茵衣藻DOF工程藻含有熱激啟動子HSP70A-RBCS2，可過表達DOF基因.載體PMAA7IR來源于深圳海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境科學(xué)重點實驗室，載體PMAA7IR包含啟動子RBCS2、用于5-FI篩選的MAA7 基因、EcoRⅠ酶切位點和潮霉素基因.

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基采用TAP培養(yǎng)基.初始接種細胞濃度5×104個/mL，光照強度60 μmol/m2·s.熱激條件為藻株生長至第4 d水浴40 ℃ 30 min后正常培養(yǎng).

1.3 載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

1.3.1 載體的構(gòu)建

引物序物列如表1.分別以引物1擴增萊茵衣藻CIS的3′UTR片段，以引物2擴增萊茵衣藻LACS的3′UTR片段；分別以擴增片段CIS和LACS為模板，引物3擴增CIS反向互補片段，以引物4擴增LACS反向互補片段.間隔序列sp片段則由引物5擴增.連接后插入pMaa7IR載體，獲得PMAA7IR/LACS2-CIS1 IR沉默載體.擴增程序如下：(1)95 ℃,3 min；(2)94 ℃,30 s；(3)60 ℃,30 s；(4)72 ℃,50 s；(2)～(4)30個循環(huán)；(5)72℃,5 min.

表1 用于擴增PCR引物

1.3.2 萊茵衣藻轉(zhuǎn)化

將PMAA7IR/LACS2-CIS1 IR沉默載體利用珠磨法轉(zhuǎn)入DOF工程藻.轉(zhuǎn)化后藻株轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管，并在弱光25 ℃、100 r/min培養(yǎng)過夜.5000 r/min離心5 min收集藻細胞.涂于色氨酸、潮霉素和5-FI的 TAP固體平板，平板倒置于25 ℃，光照60 μmol/m2·s培養(yǎng).

1.4 中性脂含量測定

取對數(shù)期細胞，0.01 M PBS緩沖液洗兩遍，吸取980 μL稀釋藻液轉(zhuǎn)移至流式細胞管，加入20 μL的BODIPY505/515染液.BD FACSCalibur流式分析儀，選取FITC通道，讀數(shù)10000個細胞，每個樣重復(fù)3次.

1.5 脂肪酸含量測定

藻粉10 mg置于15 mL玻璃管，加入2 M NaOH-CH3OH溶液反應(yīng)，再加入4 M HCl-CH3OH溶液，正己烷萃取后氮吹儀吹干.500 μL CH2Cl2懸浮，并轉(zhuǎn)移至色譜進樣瓶中，上機檢測.GC-MS氣相色譜柱為VF-23 MS，柱子規(guī)格為30.0 m×320 μm×0.25 μm，最高溫度為260 ℃.進樣口溫度為250 ℃，采用分流進樣模式，分流比為10∶1，載氣為高純He.柱溫箱升溫程序：(1)70 ℃，4 min；(2)25 ℃/min速率升溫至195 ℃；(3)3 ℃/min速率升溫至205 ℃；(4)8 ℃/min速率升溫至230 ℃，保持1 min.質(zhì)譜檢測器選擇全掃描模式，氣相色譜-質(zhì)譜傳輸線溫度為250 ℃.

1.6 生長曲線、淀粉和可溶性蛋白質(zhì)的測定

利用血球計數(shù)板每隔24 h記錄細胞數(shù)目測定生長曲線.淀粉測定按照淀粉提取試劑盒(Solarbio)說明提取并檢測.蛋白質(zhì)測定條件為：藻液2 mL離心加入PBS緩沖液沖洗，加入200 μL BugBuster Protein Extraction Reagent(默克)裂解液，水浴在30 °C震蕩反應(yīng)30 min，離心取上清液稀釋至標準曲線的直線范圍，酶標儀檢測.

1.7 基因表達量檢測

按照Trizol說明書提取RNA,用PrimeScriptTMRAT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA.按照KOD SYBR qPCR Mix Kit(Toyobo)用于qRT-PCR的檢測.以β-actin為內(nèi)參.其程序為：(1)98 ℃ 2min；(2)98 ℃ 10 s，(3)60 ℃ 30 s，(4)72 ℃ 30 s，(2)～(4)40個循環(huán).

2 結(jié)果

2.1 三基因工程藻的篩選及其分子生物學(xué)分析

通過重疊擴增PCR法連接LACS2基因的3′UTR片段和CIS1基因3′UTR片段形成串聯(lián)反向重復(fù)序列(圖1)，插入至EcoRⅠ限制性酶切位點的沉默載體PMAA7IR，得到重組載體(PMAA7IR/LACS2-CIS1 IR).將重組載體采用珠磨法轉(zhuǎn)入DOF工程藻，在含有濃度為12.5 μg/mL潮霉素和濃度5 μM的5FI的TAP平板篩選三基因工程藻的轉(zhuǎn)化子(圖2a).提取部分轉(zhuǎn)化子的基因組DNA進行PCR檢測基因組驗證，顯示PMAA7IR/LACS2-CIS1 IR已成功整合到DOF工程藻株基因組DNA中(圖2b).利用熒光染色法測定150株三基因工程藻中性脂含量，發(fā)現(xiàn)33株三基因工程藻中性脂含量較野生型cc849高(圖2c).其中工程藻DLC-4、DLC-7 和DLC-8脂質(zhì)含量較高，與野生型cc849相比，工程藻DLC-4脂質(zhì)含量增加了74%(圖2d).分析基因表達量表明，三基因轉(zhuǎn)化藻株DLC-4和DLC-8中LACS2和CIS1均下調(diào)表達，其中DLC-4與對照組相比分別下調(diào)表達58%和26%(圖2e).上述結(jié)果表明，DOF-LACS2-CIS1三基因轉(zhuǎn)化藻株構(gòu)建成功.

(a)重疊PCR合成LACS2-CIS1反向重復(fù)片段；(b)沉默載體PMAA7IR示意圖；(c)重組載體(pMaa7IR/LACS2-CIS1 IR); 箭頭代表引物

(a)工程藻轉(zhuǎn)化株;(b)雙基因LACS2-CIS1和熒光素酶的基因組驗證；(c)通過中性脂篩選轉(zhuǎn)化株；(d)選定的轉(zhuǎn)化株；(e)qRT-PCR驗證雙基因LACS2-CIS1的表達量；*P < 0.05,** P< 0.01,***P<0.001,student t test(n=3)

2.2 三基因共調(diào)控藻株的生理生化特性

微藻生物量在生物燃料、高價值營養(yǎng)品等產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)起著很重要的因素.對比三基因藻株(DLC-4)與cc849(WT)的生長(圖3a)，在8 d的培養(yǎng)期間，2種微藻生長趨勢相似，均可以達到較高細胞密度1.4×107個/mL.DLC-4在接種后的第4 d進入平臺期，比WT提前1 d.胞內(nèi)中性脂隨著細胞的生長不斷積累，在對數(shù)期后期和平臺期積累的油脂最高(圖3b)，DLC-4的中性脂在第5 d以后趨于平穩(wěn)，而WT的中性脂在第5 d達到最大值.對比培養(yǎng)第6 d藻株的蛋白(圖3c)，淀粉(圖3d)以及脂肪酸(圖3e)的含量，發(fā)現(xiàn)與WT相比，DLC-4的蛋白和淀粉含量略微下降，淀粉含量分別為73.64 mg/g和66.90 mg/g；蛋白含量分別為134.29 mg/g和122.99 mg/g；而胞內(nèi)脂肪酸含量上升了31%.這說明降低CIS1和LACS2活性引導(dǎo)更多的碳流量流向脂肪酸合成[2]和減少了脂肪酸的氧化[4].

(a)生長曲線；(b)對數(shù)后期及平臺期的中性脂含量；(c)蛋白含量；(d)淀粉含量；(e)脂肪酸含量；*P<0.05,student t test(n=3)

2.3 熱誘導(dǎo)后三基因共調(diào)控藻株的生理生化特性

由于DOF工程藻具有熱激啟動子，因此藻細胞正常培養(yǎng)至第4 d熱激誘導(dǎo)，第5 d以后2種微藻的生長均受到影響(圖4a).熱激后的DLC-4(HDLC-4)的中性脂在第6 d最大(圖4b).WT與熱激后的WT(HWT)相比脂肪酸含量無明顯差異(圖4c).HDLC-4與熱激前比較淀粉含量分別為112.82 mg/g和61.91 mg/g(圖4d)，蛋白濃度分別為163.86 mg/g和124.57 mg/g(圖4e)，淀粉和蛋白含量下降了45%和24%，而脂肪酸含量上升了52%(圖4f).說明在熱激啟動作用下，隨著DOF轉(zhuǎn)錄因子的過表達，三基因共調(diào)控的手段可能減少微藻的淀粉和蛋白的含量，為脂肪酸合成提供所需的前體和能量，促進脂肪酸含量提高更多.

(a)生長曲線；(b)對數(shù)后期及平臺期中性脂含量；(c)WT 和 HWT脂肪酸含量對比；(d)HWT 和 HDLC-4淀粉含量對比；(e)HWT 和 HDLC-4蛋白含量對比；(f)HWT 和 HDLC-4脂肪酸含量對比; *P<0.05,**P< 0.01,student t test(n=3)

3 分析與討論

DOF、LACS2 和CIS1 基因參與細胞內(nèi)多種代謝活動，是細胞內(nèi)代謝途徑的關(guān)鍵酶.小球藻過表達大豆DOF基因上調(diào)了長鏈酰基輔酶A合成酶和乙酰輔酶A活性增加脂肪酸含量[7].ACS參與細胞脂肪合成和降解.2016年在衣藻中發(fā)現(xiàn)兩個ACS基因[4]，其中LACS2與擬南芥參與β-氧化的ACS基因相似[9].通過反義RNA干擾下調(diào)其活性增加了大量的脂肪酸含量.通過RNAi干擾CIS基因，發(fā)現(xiàn)碳通量更多的分配從頭合成脂肪酸，并上調(diào)磷脂酸磷酸酯酶(PAP)和二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的活性來增加TAG的積累[2].本研究對萊茵衣藻三基因共調(diào)控脂肪酸合成進行了分析.結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下，DLC-4脂肪酸含量相比WT提高了31%，生長趨勢基本一致，但淀粉和蛋白質(zhì)含量無顯著性變化.可能是下調(diào)的CIS1 和LACS2 基因分別發(fā)揮基因功能，引導(dǎo)更多的碳流量用于脂肪酸合成及減少了脂肪酸氧化.

在熱激誘導(dǎo)條件下，HSP70A-RBCS2啟動子驅(qū)使DOF轉(zhuǎn)錄因子高表達.WT與HWT相比脂肪酸含量無明顯差異.據(jù)報道，熱激環(huán)境下可促進衣藻的膜脂直接轉(zhuǎn)化為TAG作為儲蓄物質(zhì)而不影響脂肪酸和淀粉含量[10].這也排除了熱激作為外界環(huán)境影響脂肪酸、淀粉的含量變化的可能.HDLC-4胞內(nèi)總脂肪酸比HWT相比提高了52%，但蛋白和淀粉含量分別下降了24.0%和45%.表明在三基因共調(diào)控下，淀粉和蛋白的減少可能為脂肪酸合成提供所需的前體和能量.

研究表明，過表達硅藻雙基因Δ5去飽和酶(PtD5)和丙二酰輔酶A?；d體蛋白轉(zhuǎn)?；?MCAT)基因增加長鏈不飽和脂肪酸(EPA、ARA、DHA)的含量[11].過表達柵藻Scenedesmusquadricauda的三基因，包括乙酰輔酶A羧化酶ACC1、甘油激酶(GPD1)和磷酸甘油脫氫酶(GUT1)，與野生型相比油脂顯著增加[12].工程藻DLC-4雖能提高油脂含量，但作為高產(chǎn)油脂藻株應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，還需要參考更多基因組合,進行后續(xù)研究.

4 結(jié)語

通過將雙基因沉默載體(LACS2-CIS1)轉(zhuǎn)入萊茵衣藻DOF工程藻中，構(gòu)建了萊茵衣藻三基因共調(diào)控藻株.與萊茵衣藻cc849相比，三基因藻株生長狀態(tài)相似，淀粉和蛋白無明顯改變，但胞內(nèi)中性脂含量明顯增加，且脂肪酸含量上升了31%.在熱激啟動作用下，三基因藻株淀粉和蛋白含量下降了58%和26%，胞內(nèi)中性脂含量增加74%，脂肪酸含量上升了52%.故通過共調(diào)控三基因DOF-LASC2-CIS1顯著提高了萊茵衣藻的脂質(zhì)含量，也證明了使用多個基因改造技術(shù)在衣藻工程藻應(yīng)用中具有重要的潛力，這為未來微藻生物資源利用發(fā)展提供了一個新思路.