黃先菊，董悅，王晶，佟海英，陳路遙,崔競文

(1 中南民族大學 藥學院，武漢430074；2 北京中醫(yī)藥大學 民族醫(yī)藥學研究所，北京 100029)

風濕炎癥性疾病包括類風濕性關節(jié)炎(RA)、銀屑病關節(jié)炎、強直性脊柱炎等多種以炎癥為主要誘導致病因素的風濕病，目前此類疾病患病率逐漸增加，在不同的年齡段均可發(fā)生，多見于中老年人.扎沖十三味丸又名嘎日迪-13，是蒙藥傳統(tǒng)方劑之一，本方出自《至高要方》，現(xiàn)已被《藥典》收錄.其共由制草烏、沉香、丁香、甘草、木香、訶子、肉豆蔻、石菖蒲、煅磁石、制珊瑚、制珍珠、禹糧土、麝香13味藥組成，在臨床上常用于風濕性關節(jié)炎、坐骨神經痛等疾病的治療[1-4].但扎沖十三味丸治療風濕炎癥性疾病的作用機制尚未見系統(tǒng)闡明.本方組成復雜，由8味植物藥、2味動物藥及3味礦物藥組成，因植物藥在方中占比較大，且動物藥與礦物藥網絡預測研究較少，數(shù)據(jù)庫查找相對比較復雜，故本研究僅對扎沖十三味丸中8種植物藥進行網絡藥理學方法分析，從系統(tǒng)、整體的角度將藥物與疾病聯(lián)系起來，預測其植物藥成分作用此類疾病的成分靶點，進一步預測其潛在作用機制.

1 方法

1.1 扎沖十三味丸活性成分的篩選

通過藥理學分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫對扎沖十三味丸中草烏、沉香、木香、甘草、丁香、訶子、肉豆蔻以及石菖蒲8種中藥進行成分檢索，以口服生物利用度(OB)大于30%及藥物相似度(DL)大于0.18為條件，結合文獻研究篩選出以上中藥的主要活性成分.

1.2 扎沖十三味丸活性成分的靶點預測

將扎沖十三味丸的活性成分輸入到 PubChem 數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，得到化合物的“Canonical SMILES”，然后將每個活性成分的“Canonical SMILES”輸入 SwissTarget Prediction 平臺(http://www.swisstarget prediction.ch/)，物種選擇“人類(homo sapiens)”，預測扎沖十三味丸活性成分的潛在作用靶點.

1.3 扎沖十三味丸抗風濕炎癥性疾病的相關作用靶點預測

使用GeneCards(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)、OMIM(http://omim.org/)及PHARMGKB(https://www.pharmgkb.org/)3個疾病靶點數(shù)據(jù)庫，以“rheumatism”、“rheumatoid”、“arthralgia”及“sciatica”為關鍵詞進行檢索，刪除重復基因.將獲得的疾病靶點與活性成分靶點進行對比，得出共同靶基因.

1.4 扎沖十三味丸抗風濕炎癥性疾病的靶蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)網絡構建

登 錄 Sring 數(shù) 據(jù) 庫(https：//string-db.org/)，輸入 1.3 項下收集共同靶基因，設置物種為“人類(homo sapiens)”，最低相互作用閾值為中等置信度(medium confidence)，其余參數(shù)保持默認，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，構建 PPI 網絡.通過 Cytoscape 3.2.1軟件構建扎沖十三味丸的成分-靶點-疾病網絡.

1.5 GO功能富集與 KEGG通路富集分析

將所得的成分與疾病共同靶基因通過DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體論(Gene Oncology,GO)分類富集分析和全基因組及代謝途徑富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)，通過GO分類富集提取靶標基因或蛋白質的分子功能(Molecular Function,MF)、細胞組分(Cellular Component,CC)，及其所參與的生物學反應(Biological Process,BP)，通過這三個功能大類，對一個基因的功能進行多方面的限定和描述。通過KEGG通路(pathway)富集靶點所涉及的信號通路，以P< 0.01 及基因數(shù)≥10為條件進行靶基因篩選，分析扎沖十三味丸抗風濕炎癥性疾病主要信號通路及生物過程.

2 結果

2.1 扎沖十三味丸活性成分及靶點篩選

對扎沖十三味丸中8種植物類中藥進行活性成分篩選，按照 OB大于30%，DL大于0.18 的篩選條件，一共獲得93個活性成分，389個預測靶點.方中各味藥活性成分和預測靶點數(shù)量見表1，利用 Cytoscape 3.6.1 軟件可構建成分-靶點網絡圖，見圖1.

表1 扎沖十三味丸“中藥-成分-靶點”基本信息

圖1 扎沖十三味丸成分-靶點網絡圖

2.2 扎沖十三味丸抗風濕炎癥性疾病活性靶點預測

使用OMIM等3個疾病數(shù)據(jù)庫，檢索到625個相關基因靶點.將389個活性成分靶點與625個疾病靶點進行對比，最終得到61個共有靶點，見表2.并通過 Cytoscape 3.2.1 軟件構建扎沖十三味丸的成分-靶點-疾病網絡，見圖2.

表2 扎沖十三味丸治療風濕炎癥性疾病的作用靶點

圖2 扎沖十三味丸成分-靶點-疾病網絡圖

2.3 共同靶蛋白PPI網絡構建

通過 STRING 數(shù)據(jù)庫分析 61個映射得到的風濕炎癥性疾病交集靶點，構建預測扎沖十三味丸治療風濕炎癥性疾病靶點 PPI 網絡，結果見圖3.利用 Cytoscape 3.2.1軟件的篩選工具，篩選出該網絡中degree值大于30的靶蛋白，分別為凝血因子Ⅹ(F10)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)、β2腎上腺素能受體(ADRB2)、前列腺素 G/H 合酶 1(PTGS1)、絲裂原活化蛋白激酶 14(MAPK14).

圖3 扎沖十三味丸抗風濕炎癥性疾病靶蛋白PPI網絡圖

2.4 GO功能富集分析

GO功能分析結果顯示，以靶點數(shù)大于10且P<0.01 為篩選條件，可篩選出參與藥效的主要分子功能(MF)有蛋白結合、酶結合及蛋白質均聚活性功能；參與藥效的主要細胞組分(CC)有細胞外空間、細胞外區(qū)域、細胞表面等；參與藥效的主要生物學過程(BP)有炎癥反應、免疫反應、NF-kappaB轉錄因子活性正調控、基因表達正調控、凋亡過程負調控等.其所包含的靶點數(shù)見圖4.

圖4 GO功能富集分析

2.5 KEGG富集分析

KEGG富集分析結果顯示，以靶點數(shù)大于10且P<0.01為篩選條件，篩選出主要信號通路有18條，作用靶點及其所在信號通路見表3.

表3 KEGG通路富集

結果顯示：扎沖十三味丸中活性成分通過作用于人體中風濕炎癥性的相關靶點，對體內信號通路如 TNF 信號通路、破骨細胞分化信號通路、Toll樣受體信號通路、癌癥通路、類風濕性關節(jié)炎信號通路、MAPK信號通路、細胞因子受體相互作用信號通路等產生影響，最終影響疾病的發(fā)生發(fā)展，見圖5.

圖5 KEGG通路富集分析

3 討論

近年來，對于風濕炎癥性疾病[5-7]中的RA的相關機制研究較多，研究表明基質金屬蛋白酶(MMPs)在RA的發(fā)病機制中有著重要作用，MMPs失調會影響腫瘤壞死因子(TNF)、白介素-1(IL-1)等上調或抑制[8-9].還有研究表明JAK2/STAT3信號通路廣泛參與了 RA 患者滑膜細胞的增殖、凋亡、炎癥反應、血管翳形成和機體的免疫調節(jié)等過程[10]，如何通過減少滑膜細胞的增殖、促進滑膜細胞凋亡和抑制對風濕因子的分泌都成為臨床治療中的重要研究方向.扎沖十三味丸在蒙醫(yī)藥理論中，為治療白脈病之方.白脈病系指赫依、血交博，損及白脈引起的以麻木、腫痛、萎縮、拘攣為特征的病證，又稱“白痹”[11-12].本方功能祛風通竅、舒筋活血、鎮(zhèn)靜安神、除“協(xié)日烏素”，能主治半身不遂、左右癱瘓、口眼歪斜、四肢麻木、腰腿不利、語言不清、筋骨疼痛、神經麻痹、風濕、關節(jié)疼痛[13].

在現(xiàn)代研究與經典理論背景下，本研究在扎沖十三味丸治療類似疾病靶點預測方面，得到了大量相關靶點基因，如基質金屬蛋白酶系(MMP1/MMP3/MMP8/MMP9)、白介素(IL-2/IL-6/IL-8/IL1A/IL1B)、趨化因子(CXCL10/CXCL11/CCL2)、TNF等炎癥相關靶點基因，結果與已有的研究相關疾病結果符合.通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)：與細胞的增殖、凋亡、炎癥反應和機體的免疫調節(jié)等過程相關的結果共有6條，如炎癥反應、免疫反應等，與已有研究也較符合.KEGG通路富集結果顯示：扎沖十三味丸可能通過TNF、破骨細胞分化、Toll樣受體、癌癥、類風濕性關節(jié)炎、MAPK、細胞因子受體相互作用等信號通路對風濕炎癥性疾病發(fā)揮作用，而這類通路與細胞的增殖、凋亡、炎癥/免疫反應也密切相關，其結果與GO分析也較為符合.

綜上所述，本研究基于網絡藥理學分析方法[14]得出:扎沖十三味丸治療風濕炎癥性疾病可能是通過TNF、破骨細胞分化等信號通路對細胞增殖、凋亡、炎癥反應和機體的免疫調節(jié)等過程產生影響而發(fā)揮作用，該預測的成分、靶點、途徑等具有可信性，可為后續(xù)實驗驗證研究提供較為可靠的依據(jù).