孫倩男 王棟 周雪梅 張建平（內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗研究院-中蒙藥標(biāo)準(zhǔn)研究實驗室呼和浩特010020）

苦檀子，豆科植物厚果崖豆藤Millettia pachycarpa Benth.的干燥成熟種子，植物多分布于福建、廣西、四川、貴州、云南等地，具有攻毒止痛、消積殺蟲之功效，常用于疥癬瘡癩、痧氣腹痛、小兒疳積。苦檀子中主要含有魚藤酮和擬魚藤酮，除此之外還含有β-谷甾醇（Ⅰ）、齊墩果酸（Ⅱ）、水黃皮素（Ⅲ）、厚果雞血藤甲素（Ⅳ）等成分[1]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，存在于某些植物或種子中，具有降血脂、抗癌、抗炎癥等作用，可作為苦檀子質(zhì)量控制的指標(biāo)。本實驗用HPLC法測定苦檀子中β-谷甾醇含量，由于直接使用溶劑提取β-谷甾醇干擾物質(zhì)較多，利用β-谷甾醇不發(fā)生皂化反應(yīng)這一特點，通過皂化反應(yīng)還原大部分干擾物質(zhì)使得β-谷甾醇可以準(zhǔn)確定量。同時通過單因素實驗和正交實驗對提取方法進行優(yōu)化，使該法操作簡便，定量準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器：苦檀子（購于安國云天）；β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度：97%）（中國食品藥品檢定研究院，批號：110851-201608）；氫氧化鉀（天津南開大學(xué)分校特種試劑實驗廠，批號：20020410）；乙醇（AR）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20180223）；甲醇（HPLC）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：WXBC6196V）；乙腈（HPLC）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：WXBC6307V）。遠(yuǎn)紅外鼓風(fēng)干燥箱（天津市華北實驗儀器有限公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；低速大容量離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；島津LC-20A型高效液相色譜儀，配有紫外檢測器。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC測定 β-谷甾醇的條件：Apollo C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-乙腈（體積比 60∶40），檢測波長 210 nm（0～30 min），柱溫 40 ℃；流速 1.2 mL·min-1，進樣量 20 μL，以 50 μg·mL-1β-谷甾醇正己烷溶液進行外標(biāo)法定量。

1.2.2 苦檀子中β-谷甾醇的提?。喝】嗵醋蛹?xì)粉2 g，加20 mL乙醇溶液和若干毫升50% KOH溶液，密封，劇烈振搖后在一定溫度下皂化若干小時[2]。半小時內(nèi)10 min振搖1次，之后每半小時振搖1次。趁熱加入10 mL水，用10 mL正己烷振搖提取1次，再加正己烷振搖提取2次，每次5 mL，合并正己烷液，定容至25 mL容量瓶中，過0.45 μm有機微孔濾膜后，進行HPLC測定。

2 皂化法提取苦檀子中β-谷甾醇單因素實驗及正交實驗優(yōu)化

苦檀子的特點是子葉占據(jù)種子的90%以上，含大量的油脂及糖類，測定β-谷甾醇干擾眾多，采用皂化反應(yīng)法將干擾物質(zhì)反應(yīng)除去。皂化反應(yīng)主要影響因素為溫度、時間、皂化液濃度，本研究以單因素實驗及正交試驗進行條件優(yōu)化，得到最佳提取條件。

2.1 皂化法提取苦檀子中β-谷甾醇單因素實驗

2.1.1 皂化液加入體積對β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”在皂化溫度為80℃，皂化時間為2 h時考察皂化液加入體積對β-谷甾醇提取量的影響。

2.1.2 皂化時間對β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”在皂化溫度為80℃，皂化液加入體積為10 mL時考察皂化時間對β-谷甾醇提取量的影響。

2.1.3 皂化溫度對β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”在皂化時間為2 h，皂化液加入體積為10 mL時考察皂化溫度對β-谷甾醇提取量的影響。

2.2 苦檀子中β-谷甾醇提取工藝正交實驗優(yōu)化：選用L16（4，5）正交表對苦檀子中β-谷甾醇提取方法進行正交實驗優(yōu)化，正交實驗因素及水平見表1。

表1 正交實驗因素及水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

3 方法學(xué)考察

3.1 線性：取 β-谷甾醇對照品溶液（50 μg·mL-1），分別進樣 1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進樣量（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-谷甾醇對照品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=177784X+692.77，r=0.9999，表明β-谷甾醇對照品進樣量在0.05～1 μg間線性關(guān)系良好。

3.2 精密度實驗：取β-谷甾醇對照品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6次，每次進樣20 μL，記錄峰面積。計算RSD值即相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.51%，表明儀器誤差小，精密度高。

3.3 重復(fù)性實驗：取供試品粉末5份，每份2.000 g，精密稱定。按照最優(yōu)提取方法制備5份供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進樣分析，測定β-谷甾醇峰面積，計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。計算RSD為1.10%，說明重復(fù)性好，供試品溶液制備方法可行。

3.4 穩(wěn)定性試驗：取按照最優(yōu)提取方法制備的供試品試樣液，室溫放置，分別于 0 h、2 h、6 h、12 h 和 24 h 按“1.2.1”項下色譜條件進樣分析，測定樣品中β-谷甾醇含量的RSD值為1.70%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 回收率實驗：按照最優(yōu)提取方法，供試品樣中分別加入0.5 mL、0.68 mL、0.82 mL 50 μg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，正己烷定容至5 mL。按“1.2.1”項下色譜條件進行測定，計算苦檀子樣品中的β-谷甾醇的回收率。平均回收率為118.8%，RSD為0.94%。

4 結(jié)果與討論

4.1 HPLC測定苦檀子中β-谷甾醇含量：分別對β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品、苦檀子皂化后收集的正己烷液以及乙醇溶液直接超聲提取的苦檀子樣品進行HPLC測定，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，苦檀子皂化后收集的正己烷液中β-谷甾醇（B）的保留時間（min）與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（A）一致，峰形對稱，分離效果良好。而未經(jīng)皂化反應(yīng)直接用乙醇超聲處理得到的苦檀子樣品（C），由于干擾物質(zhì)與β-谷甾醇保留時間相近，β-谷甾醇未能得到良好的分離。由此可見，利用皂化反應(yīng)的原理，大部分干擾物質(zhì)經(jīng)皂化轉(zhuǎn)化成醇和羧酸鹽等水溶性物質(zhì)，經(jīng)過水與正己烷的萃取使得干擾物質(zhì)與β-谷甾醇分離，實現(xiàn)了樣品的凈化。

4.2 皂化法提取苦檀子中β-谷甾醇單因素實驗及正交試驗優(yōu)化

4.2.1 皂化液加入體積對β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”，考察皂化液加入體積對β-谷甾醇提取量的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著加入皂化液的體積逐漸增大，β-谷甾醇的提取量逐漸升高。當(dāng)加入的皂化液體積達到10 mL時，β-谷甾醇的提取量最大。繼續(xù)加入皂化液，β-谷甾醇的提取量降低并趨于平穩(wěn)。因此，選擇最佳加入皂化液體積為10 mL。

4.2.2 皂化時間對β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”，考察皂化時間對β-谷甾醇提取量的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)加入皂化液的體積為10 mL，皂化溫度為80℃時，隨著皂化時間的延長，β-谷甾醇的提取量先升高；當(dāng)皂化時間為2 h時，β-谷甾醇的提取量最大；繼續(xù)延長皂化時間，β-谷甾醇提取量呈現(xiàn)下降趨勢并趨于平穩(wěn)。因此，選擇最佳皂化時間為2 h。

4.2.3 皂化溫度對β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”，考察皂化溫度對β-谷甾醇提取量的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著皂化溫度升高，β-谷甾醇的提取量先升高后降低；當(dāng)皂化溫度為80℃時，皂化效果最佳，β-谷甾醇的提取量最高。因此，選擇最佳皂化溫度為80℃。

4.2.4 苦檀子中β-谷甾醇提取工藝正交試驗優(yōu)化：選用L16（4，5）正交表進行正交試驗優(yōu)化，正交實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

由表2可知，RA＞RB＞RC，即皂化液加入體積＞皂化時間＞皂化溫度。結(jié)合單因素實驗結(jié)果優(yōu)選出最佳工藝組合為A4B2C2，即最佳提取工藝條件為皂化液加入體積10 mL，皂化時間2 h，皂化溫度80℃。

結(jié)合單因素實驗與正交優(yōu)化的結(jié)果，皂化液加入體積對β-谷甾醇提取量的影響最大，可能是由于皂化液的量直接決定皂化反應(yīng)是否完全，從而最大程度除去樣品中的干擾物質(zhì)，使β-谷甾醇與其較好分離。而皂化時間過長會使β-谷甾醇部分氧化分解進而造成含量降低[3]，所以控制皂化時間可保證β-谷甾醇在獲得良好分離的基礎(chǔ)上不發(fā)生氧化分解，保證提取量不被影響。由于皂化反應(yīng)本身屬于放熱反應(yīng)，所以只需要反應(yīng)初期有一個適宜的溫度加快反應(yīng)，所以皂化溫度對于β-谷甾醇提取量的影響最低。

5 結(jié)論

通過考察加入皂化液體積、皂化溫度及皂化時間對高效液相色譜法測定苦檀子中β-谷甾醇提取量的影響，優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件為：加入10 mL皂化液，皂化時間2 h，皂化溫度80℃。在最佳提取工藝條件下得到β-谷甾醇回收率為118.8%，RSD為0.94%，測得苦檀子中β-谷甾醇含量為0.020%。該方法操作簡單，分離效果良好，結(jié)果準(zhǔn)確。