徐梓馨 羅昕 羅聲政 徐銘益 林仁坤

非酒精性脂肪性肝病(nonalchoholic fatty liver disease,NAFLD)是以脂肪在肝臟異位沉積為特征的一組臨床病理綜合征[1-2]。近年隨著生活水平的提高和飲食習慣的改變， NAFLD 的患病率不斷提高，但是對于NAFLD 發(fā)病機制的研究尚不完全清楚，治療選擇有限[3-5]。microRNA(miRNA)是一類高度保守的組織特異性小非蛋白質(zhì)編碼RNA，在細胞生長、分化和死亡等過程中起重要作用，其表達失調(diào)會引起疾病[6-7]。miRNA已被證明在嚙齒動物和人類肝病中具有預(yù)后和預(yù)測價值[8-10]。文獻報道m(xù)iR-27、miR141、miR-212-5p、miR-122、miR-34a和miR-16等在慢性肝病中發(fā)揮重要作用[12-16]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27參與調(diào)節(jié)脂肪細胞和巨噬細胞中的脂質(zhì)代謝，并與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[17]。

研究表明，轉(zhuǎn)分化(或“激活”)的肝星狀細胞是分泌基質(zhì)蛋白的成肌纖維細胞的主要細胞來源，是肝纖維化的主要驅(qū)動力[18]。本研究通過觀察過表達 miR -27a 之后肝星狀細胞脂質(zhì)沉積變化和相關(guān)脂質(zhì)代謝蛋白的表達水平，以及脂肪肝模型小鼠 miR -27a 表達水平和相關(guān)脂質(zhì)代謝蛋白水平的變化，探討肝星狀細胞中 miR -27a 表達水平與肝脂肪變的關(guān)系。

資料與方法

一、材料與試劑

實驗小鼠購于中國科學院上海實驗動物中心，LX2細胞保存于上海市第一人民醫(yī)院臨床轉(zhuǎn)化院實驗室，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國 Hyclone公司、0.25%的胰蛋白酶、膠原酶Ⅰ均購自上海曜登生物科技有限公司，LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑購 自 美 國 Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本 TaKaRa公司，SYBR GreenPCR 試劑盒購自美國 ApplideBiosystem公司，PCR引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，HE、天狼星紅染色試劑購于上海萌椏生物科技有限公司。

二、方法

(一)實驗動物 健康雄性C57BL/6小鼠10只，SPF級，約 4周齡，體質(zhì)量 12～15 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院實驗動物中心，自由飲水，溫度濕度符合標準，實驗小鼠隨機分為普通飲食加CCL4組、高脂加CCL4組，每組各5只，均腹腔注射CCL4,分別給予普通飼料，高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)至8周處死，部分肝組織放于14% 甲醛溶液中，石蠟包埋組織學染色；同時留取少量組織存放于-80℃冰箱用于后續(xù)PCR。

(二)細胞培養(yǎng) 采用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人星狀細胞，置于 37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。加入 0.25% 的胰蛋白酶消化細胞，并進行傳代。傳代時，將細胞懸液均勻地分配至細胞培養(yǎng)皿中，完全培養(yǎng)基補充至每皿 6 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)需要收集細胞,用于PCR、油紅染色實驗。

(三)肝臟組織病理檢查 肝組織固定48 h后，常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋。以4 μm厚度進行石蠟組織切片， HE和天狼猩紅染色，光學顯微鏡下檢測其病理程度并拍照。

(四)過表達 miR-27a的LX2細胞建立 取生長狀態(tài)良好的LX2細胞接種于6孔板中，每孔加入 2×105個細胞，當細胞融合度達到80%左右時，使用 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒進行轉(zhuǎn)染， 瞬時轉(zhuǎn)染按照說明書進行。設(shè)置空白對照組、過表達組(miR-27a)，轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/mL 的miR27a mimics，轉(zhuǎn)染48 h；

(五)qRT-PCR 法檢測 miR-27a、FAS、SCD1相對表達量 按照試劑說明書采用TRIzol法提取總RNA并純化, 利用 Nanodrop 系統(tǒng)測定 RNA 樣品的濃度和純度，檢測 260 nm 和 280 nm 下吸光度(A)值，判斷樣品純度是否符合實驗要求。測定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行RT-PCR。RT-PCR引物序列見表1。實驗過程中以U6 、β-actin分別作為miRNA-27a、FAS、SCD1 的內(nèi)參對照, 進行標準化轉(zhuǎn)換得到各樣本的拷貝數(shù)(Ct 值), 樣品目的基因的相對表達率(Relative expression，RQ)采用 △△CT 方法計算，RQ=2-△△CT。每個樣品的內(nèi)參基因和靶基因各設(shè)3個重復試驗。

表1 qRT-PCR相關(guān)引物序列

(七)油紅染色檢測脂質(zhì)沉積程度 棄掉培養(yǎng)液，用PBS輕緩清洗3次，加入10%多聚甲醛固定30 min后，按照儲備液：稀釋液=5：2的比例配制染色液，配好后用慢速濾紙濾過，染色10 min，染液體積覆蓋住孔板即可，用60%異丙醇漂洗，除去多余染料，保持背景色干凈，復染12 s，封片，鏡檢。

三、統(tǒng)計學分析

正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用 SPSS16.0 統(tǒng)計軟件分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，3組間采用方差分析，偏態(tài)分布時采用非參數(shù)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、小鼠肝組織病理檢查

HE染色結(jié)果顯示普通飲食加CCL4組肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，中央靜脈周圍肝細胞索排列紊亂，匯管區(qū)可見有炎性細胞浸潤,部分肝細胞點狀壞死。高脂加CCL4組肝組織可見肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，中央靜脈周圍肝細胞索明顯紊亂,匯管區(qū)肝細胞片狀壞死，同時可見中央靜脈周圍肝細胞脂肪變性，出現(xiàn)大量大小不等的脂滴泡。天狼星紅染色顯示，普通飲食加CCL4組和高脂加CCL4組均有纖維增生，可見明顯染色成紅色的纖維間隔，如圖1。

圖1 各組小鼠肝組織光鏡下表現(xiàn) A、B：HE染色(×100)；C、D：天狼星紅染色結(jié)果(×100)

二、miR-27a在高脂加CCL4組小鼠肝組織中表達下降

在高脂加CCL4組小鼠肝組織中，miR-27a相對表達水平為(0.230±0.001,P=0.02)，普通飲食加CCL4組小鼠肝組織中miR-27a相對表達水平為(1.00±0.0021)，高脂加CCL4組miR-27a表達明顯下降，說明在CCL4誘導肝纖維化的情況下，高脂誘導肝臟脂肪變時miR-27a表達水平也會下降。

三、高脂加CCL4組小鼠肝臟組織中FAS、SCD1相關(guān)mRNA表達上升：

FAS、SCD1均為促進脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。普通飲食加CCL4組FAS與SCD1分別為(1.00±0.016)、(1.00±0.032)，高脂加CCL4組小鼠肝組織中FAS、SCD1相關(guān)的mRNA表達量明顯增高，分別為(2.23±0.24)，P=0.0267，(1.98±0.17)，P=0.011；說明在高脂喂養(yǎng)的情況下，F(xiàn)AS、SCD1的表達可增強，提示脂肪酸合成增強。

四、PA刺激后LX2細胞中miR-27a表達下降

對照組miR-27a表達為(1.00±0.131), 200 μmol/L、400 μmol/L PA刺激LX2細胞后miR-27a 的相對表達量為分別為(0.333±0.003，P=0.0024)和(0.413±0.005，P=0.001)，PA刺激常用來誘導細胞脂肪變性，提示在脂肪變性的LX2細胞中miR-27a的表達可能受到抑制。

五、過表達miR-27a后LX2細胞脂質(zhì)沉積減輕

空白對照組細胞輪廓稍變圓，細胞內(nèi)可見散在紅色脂滴分布，位于細胞膜內(nèi)側(cè)邊緣。在過表達miR-27a后48 h，LX2細胞內(nèi)鮮見脂滴，胞內(nèi)可見細胞核，邊緣清晰。如圖2。

圖2 空白對照組(A)和miRNA-27a過表達組(B)油紅染色(×200)

六、在過表達miR-27a后LX2細胞FAS、SCD1的mRNA表達下降

對照組FAS、SCD1相關(guān)mRNA表達量分別為(1.00±0.085)和(1.00±0.034) ，miR-27a過表達組中FAS、SCD1相關(guān)mRNA表達量分別為(0.21±0.001)和(0.35±0.005)，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，說明miR-27a過表達可能抑制FAS、SCD1的表達，F(xiàn)AS、SCD1均為促進脂肪酸合成的關(guān)鍵因素，提示miR-27a可能通過抑制下游靶基因FAS、SCD1抑制肝星狀細胞脂質(zhì)代謝。

討 論

文獻報道，miR-27在肝臟脂質(zhì)代謝紊亂時表達受到抑制[19]。Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)在肝原代細胞中，miR-27a能通過抑制脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)和硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1 ，SCD1)調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝從而減輕NAFLD。FAS、SCD1是高等動物內(nèi)源性脂肪酸合成的重要的酶，其在肝臟中的表達水平與肝臟脂肪變性的程度相關(guān)[21-23]。肝星狀細胞的活化一直被認為是肝纖維化發(fā)生的啟動步驟[18]，但肝星狀細胞在脂肪肝發(fā)生發(fā)展過程的變化鮮見報道。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，在PA誘導脂肪變性的肝星狀細胞中miR-27a相對表達量出現(xiàn)顯著下降，說明肝星狀細胞脂肪變性時，miR-27a的表達也會受到抑制。同時檢測小鼠肝臟組織中miR-27a的相對表達量發(fā)現(xiàn)，相比較普食加CCL4組的小鼠，高脂加CCL4組小鼠miR-27a表達量也明顯下降， miR-27a的表達在脂肪變性的肝細胞中受到抑制[21]。本實驗結(jié)果表明在肝臟脂肪變性時，miR-27a的表達不僅會在肝細胞中受抑制，肝星狀細胞也會出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象。將肝星狀細胞過表達miR-27a，油紅檢測脂質(zhì)沉積發(fā)現(xiàn)，相比對照組，過表達組肝星狀細胞中脂質(zhì)沉積明顯減輕，說明在肝星狀細胞中，miR-27a可能是通過抑制脂質(zhì)沉積來減緩脂肪變性的進程；同時PCR結(jié)果顯示，過表達miR-27a后的肝星狀細胞中促脂肪酸合成因子FAS、SCD1的mRNA表達量均顯著下降，而高脂加CCL4組小鼠肝組織FAS、SCD1相關(guān)mRNA表達量顯著高于普食加CCL4組小鼠的表達水平，提示在肝星狀細胞中，miR-27a可能是通過抑制這兩種酶的表達導致脂肪酸合成減少進而抑制脂質(zhì)沉積，逆轉(zhuǎn)脂肪變的發(fā)生發(fā)展。

本研究中結(jié)果表明，miR-27a可抑制肝星狀細胞的脂質(zhì)代謝，這一作用的發(fā)揮可能是通過促進FAS、SCD1在脂質(zhì)代謝過程的作用，但是進一步的相關(guān)機制尚未清楚。探討肝星狀細胞中 miR -27a 表達水平與肝脂肪變的關(guān)系，可為研究肝脂肪變提供一個不同的思路。