王 娜 肖云峰 錢新宇 韓運(yùn)祺

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院1，呼和浩特 010110) (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心2，呼和浩特 010110)

莜麥亦稱裸燕麥，是燕麥的一種，屬禾本科燕麥屬，是一年生草本作物，是一種古老糧種[1]。莜麥種子膳食纖維含量較高，可以降低膽固醇、降低血壓，在調(diào)節(jié)血脂血糖、改善腸道菌群、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等方面有重要作用[2-7]。莜麥淀粉具有其獨(dú)特的優(yōu)勢，具有良好的開發(fā)前景。莜麥淀粉具有吸油率高、水溶性低的特點(diǎn)，可作為一種易揮發(fā)、脂溶性高活性成分的包衣材料以及靶向給藥的包衣應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域。

淀粉的提取方式有很多種，主要有堿提法、酶解法、超聲法、水提法、微波輔助等。陳子月等[8]研究表明堿提法直鏈淀粉比酶解法含量多，堿提法大米淀粉對溫度更為敏感，2種大米淀粉的淀粉-碘可見光吸收光譜大致相似。張芳芳等[9]采用超聲法提取茶葉籽淀粉，在最優(yōu)條件下提取的茶葉籽淀粉蛋白質(zhì)含量為0.54%,灰分0.17%,溶解力22.19%,膨脹力40.75%;SEM圖像表明,茶葉籽淀粉顆粒呈規(guī)則的球形,平均粒度大小為1718 nm;紅外光譜分析發(fā)現(xiàn),茶葉籽淀粉處于締合狀態(tài)的氫鍵較多。張杰[10]運(yùn)用堿浸法提取黑米淀粉，淀粉顆粒形貌為不規(guī)則的多角形結(jié)構(gòu),黑米淀粉的平均粒徑為(4.39±0.11) μm。王璐陽等[11]研究了脫皮油莎豆壓榨餅中提取淀粉的工藝條件，油莎豆壓榨餅淀粉與油莎豆原料淀粉無較大差別,顆粒范圍是2～18 μm，具有相對光滑的表面結(jié)構(gòu)且淀粉粒度均小于玉米淀粉。淀粉的提取以及相關(guān)特性對于食品與藥品都有重要意義，但目前鮮有關(guān)于莜麥淀粉的提取與特性研究的文獻(xiàn)報道，本研究采用脫脂堿提復(fù)合法提取莜麥淀粉，單因素-正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，結(jié)合掃描電子顯微鏡、熒光倒置相差顯微鏡、紅外光譜儀和核磁共振對樣品進(jìn)行表征分析，研究莜麥淀粉的組成成分，旨在改進(jìn)和優(yōu)化莜麥淀粉的提取方法，以期為后來更深層次的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

莜麥種子購自內(nèi)蒙古武川縣；氘代二甲基亞砜(≥99.7%)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

DM2000熒光倒置相差顯微鏡，IRAffinity-1紅外分光光度計，S-4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，Bruker Avance 600MHz固體核磁共振波譜儀，3K15離心機(jī)，HH-S恒溫水浴鍋，BGZ-240電熱鼓風(fēng)干燥箱，HZ-9212s恒溫振蕩器，XS2-4-10箱式電阻爐。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 莜麥淀粉提取流程

莜麥種子→粉碎→過篩→脫脂(石油醚重復(fù)脫脂三次)→脫脂莜麥粉→堿液提取→離心→水洗→干燥→莜麥淀粉

莜麥種子粉碎成粉末后，過80目篩，即為原料莜麥粉。將原料莜麥粉加入到石油醚中進(jìn)行脫脂，搖床低溫振搖,時長30 min，振搖過后加入離心管中進(jìn)行離心，離心條件為3 000 r/min,15 min,離心完成后，快速傾去上層黃色液體。操作共重復(fù)3次，直至脫脂后的石油醚接近無色為止。取出置于40 ℃烘箱中烘干。以1∶10的固液比加入pH 9.5的NaOH于已經(jīng)烘干的脫脂莜麥粉中，置于搖床上50 ℃,振搖2 h。離心，棄去黃色液體，所得固體與水混勻，過600目篩，除去黃色的纖維，加入適量的蒸餾水，靜置，分層，棄去上清液，下層白色固體置于45 ℃烘箱中烘干即得莜麥淀粉。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

對影響莜麥淀粉提取率的固液比、搖床溫度和振搖時間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定這3個因素的合適水平以進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.1 不同固液比對莜麥淀粉提取率的影響

脫脂莜麥粉在NaOH(pH 9.5)浸泡的情況下50 ℃水溫的搖床振搖2 h,固液比設(shè)置為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，提取莜麥淀粉。

1.3.2.2 搖床溫度對莜麥淀粉提取率的影響

脫脂莜麥粉在NaOH(pH 9.5)浸泡的情況下?lián)u床振搖, 固液比設(shè)置為1∶10，時間設(shè)置為120 min,搖床溫度設(shè)為30、40、50、60、70 ℃，提取莜麥淀粉。

1.3.2.3 搖床振搖時間對莜麥淀粉提取率的影響

脫脂莜麥粉在NaOH(pH 9.5)浸泡的情況下?lián)u床振搖，固液比設(shè)置為1∶10，振搖時間分別為80、100、120、140、160 min。

1.3.3 提取莜麥淀粉的影響因素正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并考慮到控制生產(chǎn)成本等目的，設(shè)計三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，三因素選定為固液比(A)、搖床溫度(B)、搖床振搖時間(C)。為了排除系統(tǒng)誤差的影響，實(shí)驗(yàn)對各因素的排列順序進(jìn)行了無序重組，因素與水平設(shè)計如表1所示。

表1 莜麥淀粉提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計表

1.3.4 莜麥淀粉提取物成分的測定

1.3.4.1 水分的測定

水分含量的測定方法參照GB 5009.3—2016中的直接干燥法。

X=(m1-m2)/(m1-m3)

式中：X為樣品水分的含量/g/100 g；m1為稱量瓶+試樣質(zhì)量/g；m2為稱量瓶+試樣干燥后質(zhì)量/g；m3為稱量瓶質(zhì)量/g

1.3.4.2 灰分的測定

莜麥淀粉的灰分測定方法參照GB 5009.4—2016進(jìn)行測定。

X=(m1-m2)/(m1-m3)

式中：X為試樣中灰分的含量/g/100 g；m1為坩堝+灰分的質(zhì)量/g；m2為坩堝的質(zhì)量/g；m3為坩堝+試樣的質(zhì)量/g。

1.3.4.3 脂肪的測定

莜麥淀粉的脂肪測定方法參照GB 5009.6—2016進(jìn)行測定。

X=(m1-m0)/m1

式中：X為試樣中脂肪的含量/g/100 g；m1為恒重后接收瓶和脂肪的質(zhì)量/g；m0為接收瓶的質(zhì)量/g；m2為試樣的質(zhì)量/g。

1.3.4.4 蛋白質(zhì)的測定

莜麥淀粉的蛋白質(zhì)測定方法參照GB 5009.5—2016進(jìn)行測定。

式中：X為試樣中蛋白質(zhì)的含量/g/100 g；M為試樣的質(zhì)量/g；V1為試液消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積/mL；V3為吸收消化液的體積/mL；V2為試液空白消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積/mL；F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；C為硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液濃度/mol/L；100為換算系數(shù)。

1.3.5 莜麥淀粉顆粒形貌的測定

1.3.5.1 光學(xué)顯微鏡莜麥淀粉顆粒形貌的測定

樣品少許均勻置于載玻片上，滴加香柏油少許，顯微鏡下觀察，拍照。

1.3.5.2 掃描電鏡(SEM)莜麥淀粉顆粒形貌的測定

SEM樣品臺上貼導(dǎo)電膠，將制備得樣品粉末撒在導(dǎo)電膠上，稍微施壓使部分樣品粉末陷入到導(dǎo)電膠膠基，刀片輕輕地刮去表面多余的復(fù)合物粉末，立即噴金，電子顯微鏡觀察，拍照。

1.3.6 傅立葉紅外光譜法(FT-IR)

將莜麥淀粉樣品和溴化鉀在105 ℃干燥至恒重，除去莜麥淀粉中的結(jié)晶水或者游離水，消除樣品中水分子的存在對紅外吸收峰的干擾。以1∶100稱取莜麥淀粉樣品及溴化鉀粉末，將其研磨均勻，將研磨后的粉末裝入壓片模具中抽真空壓制成一薄片，放入紅外光譜儀中進(jìn)行掃描，以溴化鉀薄片進(jìn)行背景掃描，掃描波數(shù)400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率為4 cm-1。

1.3.7 核磁共振法(NMR)

精密稱取樣品約0.1 g置于離心管中，加入氘代二甲基亞砜0.8 mL，超聲5 min溶解，震蕩搖勻后，轉(zhuǎn)入核磁管靜置待測，采用Bruker Avance 600 MHz固體核磁共振波譜儀。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表現(xiàn)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，用Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 固液比對莜麥淀粉提取率的影響

由圖1可知，在控制振蕩器溫度以及振搖時間不變的情況下，隨著固液比的增加，提取率呈先上升后下降趨勢。適宜的固液比能夠提高莜麥淀粉的提取率，投料過多，使莜麥種子粗粉未能充分接觸堿提取液，造成莜麥淀粉的損失，堿提取液過多，導(dǎo)致后續(xù)操作步驟繁瑣，造成不必要的人力與物力的浪費(fèi)，甚至引起褐變。張晶等[2]研究表明，因燕麥中富含膳食纖維具有較強(qiáng)的吸水膨脹能力，料液比較小時，溶液較黏稠，流動性差，不利于淀粉分子的釋放，隨著料液比的增加，增大了燕麥與溶劑的接觸面積，使得淀粉提取率增加。當(dāng)料液比大于1∶10 (g/mL)時，燕麥淀粉提取率下降，可能是由于堿溶液過多導(dǎo)致溶液黏度變大，分子擴(kuò)散速率降低，且堿溶液用量的增大會增加后續(xù)排廢的難度。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，因此將固液比定在1∶10。

2.1.2 溫度對莜麥淀粉提取率的影響

由圖1可知，在控制固液比以及振搖時間不變的情況下，隨著溫度的升高，提取率呈先上升后下降趨勢，此種表現(xiàn)的原因可能是，溫度過高，莜麥淀粉可能發(fā)生糊化從而降低提取率，溫度過低，莜麥淀粉可能未被充分堿化，不能有效的從蛋白質(zhì)上脫離下來，從而降低提取率。袁曉麗[12]提取藜麥淀粉報道中提到，在一定溫度范圍，一定NaOH的作用下，使淀粉和蛋白質(zhì)的結(jié)合變得疏松，加速了蛋白質(zhì)分子運(yùn)動，使得蛋白質(zhì)容易從藜麥中溶解出來；但是，當(dāng)溫度高于50 ℃時，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，黏度增加，淀粉和蛋白質(zhì)的分離變得困難；另外，溫度過高也會導(dǎo)致淀粉的糊化，從而降低了淀粉的得率。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，因此將溫度選取在其有最高提取率時，即50 ℃。

2.1.3 振搖時間對莜麥淀粉提取率的影響

由圖1可知，在控制固液比以及溫度不變的情況下，隨著振搖時間的增加，莜麥淀粉的提取率呈先上升后下降趨勢。此種表現(xiàn)原因可能是，時間較短的情況下，堿液與莜麥種子粗粉可能未能充分混勻，時間過長，莜麥種子粗粉可能堿化時間過長，莜麥淀粉與堿液發(fā)生反應(yīng)故損失一部分，提取率從而降低。沈生文[13]提取大麥芽淀粉報道中提到，攪拌的剪切力等作用，可以使溶液變稀，體系黏度下降，也可以使大麥芽粉與提取液充分接觸，提取液可充分進(jìn)入大麥芽內(nèi)部，可以使提取液的堿度均勻，且攪拌過程中發(fā)生的碰撞也進(jìn)一步使淀粉從大麥芽組織中游離出來。但攪拌時間過長，淀粉的顆粒結(jié)構(gòu)變得疏松 ，不利于沉淀。因而影響了淀粉提取率。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，因此將振搖時間定在120 min。

圖1 不同處理對莜麥淀粉提取率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

稱取莜麥種子粗粉9份，每份5 g，精密稱定，按表2的順序依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同條件下莜麥淀粉的提取率結(jié)果見表3。

表2 莜麥淀粉的影響因素的正交實(shí)驗(yàn)

表3中各因素對莜麥淀粉的提取率依次為B>A>C,恒溫振蕩器的溫度影響最大，接下來依次為固液比以及恒溫振蕩器的振搖時間,最佳條件為A2B2C2，即固液比為1∶10。搖床溫度為50 ℃，振搖時間為2 h，測得莜麥淀粉的提取率為73.26%

表3 正交實(shí)驗(yàn)極差分析

2.3 莜麥淀粉提取物成分的測定

由表4可知，莜麥種子組成成分含量排序：脂肪>水分>蛋白質(zhì)>灰分，脂肪含量最多，達(dá)8.43 g/100 g，付麗紅等[14]報道中指出藜麥中脂肪含量5.97。比較莜麥種子與莜麥淀粉淀粉中脂肪含量和蛋白質(zhì)含量，莜麥淀粉中含量較少。這說明石油醚能有效脫去莜麥種子中脂溶性大的物質(zhì)以及蛋白質(zhì)在一定的堿性條件下易與淀粉分離，從而得到較純凈莜麥淀粉。淀粉與蛋白質(zhì)的緊密結(jié)合是淀粉提取中最難解決的一大難題，乙醇對蛋白質(zhì)外膜的水化層起到一定的脫水作用，堿性蛋白酶對蛋白質(zhì)具有一定的破壞與增溶作用。

表4 莜麥種子、莜麥淀粉組成成分/g/100 g

2.4 莜麥淀粉顆粒形貌的測定

由圖2、圖3可知，莜麥淀粉顆粒較小，且粒徑大小不一致，莜麥淀粉顆粒形狀不規(guī)則，呈多角型或橢圓形，屬于小顆粒淀粉；部分淀粉顆粒表面有凹陷，由于莜麥淀粉和蛋白質(zhì)結(jié)合非常緊密，這種凹陷可能是由于在生長過程中，蛋白質(zhì)擠壓淀粉表面而形成的，還有可能是提取淀粉的過程中，淀粉從蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中釋放時，淀粉顆粒受到破壞而形成的，淀粉的提取，即破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及破壞淀粉顆粒與母體的結(jié)合，細(xì)胞質(zhì)中含有大量的酚類，而多酚氧化酶位于細(xì)胞膜，破壞前彼此分離，無相互作用，破壞后相互接觸，形成醌，繼而形成黑色素，影響淀粉的白度，故可加入亞硫酸鈉以及VC等抑制劑[15，16]。

圖2 莜麥淀粉顆粒光學(xué)顯微鏡

圖3 莜麥淀粉顆粒電子顯微鏡

2.5 傅立葉紅外光譜法(FT-IR)

由圖4可知，莜麥淀粉在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)有多個吸收峰，主要在3 394 cm-1處有一個寬闊的吸收峰，為O—H 伸縮振動峰；在2 920 cm-1處有C—H 的伸縮振動吸收峰；在1 653 cm-1左右有H—O—H吸收峰；在1 417 cm-1處有O—H的伸縮振動吸收峰；在1 155、1 078、1 025 cm-1處有C—O伸縮振動吸收峰。這與楊慧等[17]、任靜等[18]以及張榮飛等[19]結(jié)論基本一致。

圖4 莜麥淀粉的紅外吸收光譜圖

2.6 核磁共振法(NMR)

由圖5可知，化學(xué)位移為40左右的為溶劑氘代二甲基亞砜的特征峰。C1的化學(xué)位移為 100.49，C2的化學(xué)位移在72.38，C3的化學(xué)位移在73.67，C4的化學(xué)位移在72.18，C5的化學(xué)位移在79.16，C6的化學(xué)位移為60.89。這與張舒等[20]、王萍萍等[21]結(jié)論基本一致。

圖5 莜麥淀粉的核磁共振13C譜

3 討論

以莜麥為原料，應(yīng)用脫脂堿提復(fù)合法提取莜麥淀粉，在通過單因素分析以及正交實(shí)驗(yàn)對莜麥淀粉的提取進(jìn)行優(yōu)化，并對其相關(guān)特性進(jìn)行研究。脫脂堿提復(fù)合法是一種常見淀粉提取方法，李丹丹[22]運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化堿法提取青稞淀粉，葉俊等[23]運(yùn)用堿提法提取火山葛粉淀粉。這可能是由于在一定的堿性條件下，利于蛋白質(zhì)與淀粉分離，蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落，部分蛋白溶于水，隨著淀粉的慢慢沉淀而分離。運(yùn)用光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，莜麥淀粉顆粒較小，且粒徑大小不一致，莜麥淀粉顆粒形狀不規(guī)則，呈多角型或橢圓形，屬于小顆粒淀粉,部分淀粉顆粒表面有凹陷。這可能是由于淀粉與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合，生長過程中相互擠壓形成，也有可能是粉碎過程中破壞了其結(jié)構(gòu)。吳會琴等[24]報道白蕓豆淀粉和小利馬豆淀粉都呈現(xiàn)出顆粒表面光滑，無棱角，無裂痕和大小不一的形態(tài)特征。紅外光譜與核磁共振分析發(fā)現(xiàn)，莜麥淀粉的譜圖為典型的淀粉圖譜。

莜麥淀粉可作為一種條件寬泛的包合物壁材，目前，最常見的包合物壁材是環(huán)糊精，但環(huán)糊精對其包合對象的分子大小要求極為嚴(yán)格，這直接制約了該類壁材的使用。目前，環(huán)糊精類包材只應(yīng)用于藥物或風(fēng)味物質(zhì)的增溶領(lǐng)域。淀粉在不失安全性的前提下，對包合對象的分子大小要求寬松，包埋率較高，能將客體分子包埋于螺旋結(jié)構(gòu)中形成相應(yīng)的包合物，是潛在的最佳包材研究對象。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用單因素-正交實(shí)驗(yàn)對莜麥淀粉的提取方法改善，以提取率為指征，找到一種適用于莜麥淀粉的提取方法-脫脂堿提復(fù)合法。通過對其組成成分分析，發(fā)現(xiàn)莜麥含油量較高，莜麥淀粉蛋白含量和脂肪含量較少。光學(xué)顯微鏡和SEM表明，莜麥淀粉粒徑大小不一致，呈多角型或橢圓形，屬小顆粒淀粉。紅外光譜和核磁共振表明，莜麥淀粉的譜圖為典型的淀粉圖譜。