陳 超 姜 濤 胡建蓉

(中儲(chǔ)糧成都儲(chǔ)藏研究院有限公司，成都 610031)

谷物是膳食蛋白質(zhì)的主要來源之一，其提供的氨基酸對(duì)人體生長及新陳代謝起著重要作用。生物對(duì)蛋白質(zhì)的需求本質(zhì)上是對(duì)氨基酸的需求[1]。氨基酸可提高膳食蛋白中微量元素的生物有效性[2]；賴氨酸可促進(jìn)脂肪酸被人體正常利用[3]；蘇氨酸可防止脂肪在肝臟堆積[4]。

隨著人們健康意識(shí)的日益增強(qiáng)，日常主食的營養(yǎng)功能引起人們高度關(guān)注，谷物的營養(yǎng)品質(zhì)越來越受到重視，谷物中氨基酸含量和組成，是決定其營養(yǎng)品質(zhì)和食味品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)。孟強(qiáng)等[5]利用鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測(cè)定了60份糯玉米自交系中游離氨基酸的組成及含量來篩選優(yōu)良的糯玉米品種；劉慧等[6]利用直接水解法等方法測(cè)定了655份小麥中18種氨基酸含量，評(píng)價(jià)不同地區(qū)小麥的營養(yǎng)品質(zhì)；葉霞等[7]通過測(cè)定賴氨酸和色氨酸含量變化來研究稻米的陳化過程。因此，氨基酸的快速檢測(cè)方法成為谷物育種、營養(yǎng)評(píng)價(jià)及儲(chǔ)藏研究的關(guān)鍵技術(shù)。

氨基酸自動(dòng)分析儀因其效率高被廣泛用于氨基酸測(cè)定，本研究利用LA8080氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)18個(gè)玉米中氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定。開發(fā)一種氨基酸快速測(cè)定方法，以期對(duì)后期谷物育種、營養(yǎng)評(píng)價(jià)及儲(chǔ)藏提供參考。同時(shí)，進(jìn)行試劑國產(chǎn)化研究以降低檢測(cè)成本。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

18個(gè)自然風(fēng)干的玉米樣品,市售。分別選取灌漿良好且無病蟲害的玉米籽粒，粉碎，全部通過0.25 mm標(biāo)準(zhǔn)篩，用“四分法”選取檢測(cè)樣品。

1.2 主要試劑

H型混合氨基酸標(biāo)液、R1、R2、PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-RG，均為原裝進(jìn)口試劑。

檸檬酸鈉(二水)、氫氧化鈉、氯化鈉、檸檬酸(一水)、乙醇、苯甲醇、BJ-35、辛酸、乙二醇甲醚、茚三酮、硼氫化鈉、醋酸鈉、醋酸，以上試劑均為國產(chǎn)分析純或優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 儀器與設(shè)備

LA8080高速氨基酸分析儀；ED115型烘箱；FSJ-Ⅱ錘片式旋風(fēng)磨；XS105型電子天平；Milli-Q超純水制備系統(tǒng)。

1.4 樣品前處理及氨基酸檢測(cè)

1.4.1 樣品制備

稱取過篩后充分混勻的玉米樣品2～10 g，放入已烘干至恒重的鋁制扁形稱量瓶中，置于101～105 ℃的烘箱中24 h后，取出蓋好，置于干燥器內(nèi)冷卻30 min，稱量；稱量后再復(fù)烘1 h，冷卻30 min，稱量，重復(fù)至前后質(zhì)量相差低于2 mg，并計(jì)算制備樣品水分，玉米水分計(jì)算參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》進(jìn)行。

1.4.2 樣品酸水解

樣品酸水解方法參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行。前處理后的樣品，過0.22 μm的濾膜待測(cè)。

1.4.3 氨基酸測(cè)定

利用LA8080高速氨基酸分析儀測(cè)定樣品中17種氨基酸，玉米中氨基酸的計(jì)算參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)使用 Office Excel 2010軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器分析性能測(cè)試

2.1.1 分離度

根據(jù)現(xiàn)行國家計(jì)量檢定規(guī)程JJG 1064—2011《氨基酸分析儀》相應(yīng)技術(shù)要求，通過測(cè)試蘇氨酸(Thr)～絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)～丙氨酸(Ala)、異亮氨酸(Ila)～亮氨酸(Lea)的分離度，實(shí)驗(yàn)使用原裝試劑(緩沖液和茚三酮)和氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行，做6次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。3組氨基酸分離度均滿足相關(guān)要求，各組分離度標(biāo)準(zhǔn)偏差均為0.01，說明儀器性能較穩(wěn)定。

表1 分離度測(cè)試結(jié)果

2.1.2 峰面積和峰保留時(shí)間重復(fù)性

對(duì)于峰面積和峰保留時(shí)間重復(fù)性的測(cè)試與分離度測(cè)試同時(shí)進(jìn)行，做6次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。峰面積和峰保留時(shí)間重復(fù)性均滿足要求，其中丙氨酸峰保留時(shí)間變異系數(shù)為0，重復(fù)性較好。采用原裝進(jìn)口試劑，該氨基酸分析儀測(cè)試性能符合相關(guān)性能保證指標(biāo)要求。色譜圖見圖1。由于原裝進(jìn)口試劑成本較高，所以有必要開發(fā)國產(chǎn)試劑配方，以降低檢測(cè)成本。

表2 峰面積和峰保留時(shí)間重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

圖1 原裝試劑標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.2 試劑國產(chǎn)化研究

2.2.1 緩沖液及茚三酮配方國產(chǎn)化

緩沖液pH、鈉離子濃度的變化會(huì)影響峰保留時(shí)間和峰分離度，從而影響氨基酸分離的準(zhǔn)確性。用國產(chǎn)試劑按《LA8080高速氨基酸分析儀使用說明書》配方配制出來的緩沖液可能會(huì)與進(jìn)口試劑pH值、鈉離子濃度存在差異，導(dǎo)致峰位移甚至變形，影響分離效果。高翠紅等[8]發(fā)現(xiàn)按照廠家原配方配制的PH-1緩沖液酸堿度偏酸，需添加6～7 mL的1 mol/L的氫氧化鈉才能符合實(shí)驗(yàn)要求。2019月1月逐一進(jìn)行了PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-RG及茚三酮緩沖液配方國產(chǎn)化研究實(shí)驗(yàn)，通過調(diào)整緩沖液鈉離子濃度、pH，最終得到國產(chǎn)化緩沖液配方，見表3。本配方比原配方PH-1緩沖液中檸檬酸鈉的含量多1 g；原配方中硫代雙乙醇屬于劇毒品，其與鹽酸反應(yīng)會(huì)生成芥子氣。本配方用無毒害的乙醇代替硫代雙乙醇；茚三酮反應(yīng)液配方參考王華等[9]開發(fā)的配方,用乙二醇甲醚代替二丙二醇單甲醚，醋酸鈉代替醋酸鋰，實(shí)驗(yàn)證明本配方配制的緩沖液及茚三酮反應(yīng)液，分離效果和基線均滿足實(shí)驗(yàn)要求。色譜圖見圖2。結(jié)果表明，本配方所得緩沖液實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示基線穩(wěn)定、靈敏度高、分離效果好，可替代原裝進(jìn)口試劑。

表3 緩沖液及茚三酮配制試劑國產(chǎn)化配方

圖2 國產(chǎn)試劑標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.2.2 國產(chǎn)試劑配方儀器性能測(cè)試

使用國產(chǎn)試劑配制緩沖液及茚三酮溶液，對(duì)儀器分離度、峰面積和峰保留時(shí)間重復(fù)性進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見表4和表5。采用國產(chǎn)試劑，該氨基酸分析儀測(cè)試性能符合相關(guān)性能保證指標(biāo)要求。實(shí)驗(yàn)空白見圖3，空白實(shí)驗(yàn)基線整體較平穩(wěn)，由于國產(chǎn)試劑雜質(zhì)較多，為保證儀器正常、穩(wěn)定運(yùn)轉(zhuǎn)，各緩沖液配制后須通過0.2 μm濾膜備用。

表4 國產(chǎn)試劑分離度測(cè)試結(jié)果

表5 國產(chǎn)試劑峰面積和峰保留時(shí)間重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

圖3 國產(chǎn)試劑空白色譜圖

2.2.3 國產(chǎn)試劑配方方法的線性關(guān)系、回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

將H型混合氨基酸標(biāo)液(2.5 μmol/mL)分別稀釋成濃度為10、20、40、80、100 μmol/L的混合氨基酸工作液。以各氨基酸的濃度為橫坐標(biāo)，氨基酸峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析得到線性回歸方程。

準(zhǔn)確稱取已知氨基酸含量的玉米樣品6份，前處理后，分別加入一定量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，計(jì)算其回收率和變異系數(shù),結(jié)果見表6。

表6 國產(chǎn)試劑配方方法的線性關(guān)系、回收率及精密度結(jié)果

表7 玉米中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%(以干基計(jì))

各氨基酸相關(guān)系數(shù)在0.999 2～0.999 8之間，線性關(guān)系良好；各氨基酸的回收率在99.96%～101.42%之間，變異系數(shù)范圍為0.57%～0.86%。說明國產(chǎn)試劑配方方法準(zhǔn)確度和精密度較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.3 玉米中氨基酸含量

利用LA8080高速氨基酸分析儀測(cè)定玉米中氨基酸種類及其含量，結(jié)果見表7，玉米樣品色譜圖見圖4。所測(cè)氨基酸均以干基計(jì)，谷氨酸是玉米中含量最豐富的氨基酸，玉米中含量最少的氨基酸為胱氨酸，賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.31%～0.38%。

圖4 玉米氨基酸色譜圖

脯氨酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，在440 nm處吸收峰最大。同其他氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)不同，所以在前10 min出現(xiàn)峰重疊的情況為雙通道同時(shí)檢測(cè)。

2.4 緩沖液成本與社會(huì)效益分析

自配緩沖液方法簡(jiǎn)單，且符合實(shí)驗(yàn)要求。因國產(chǎn)試劑價(jià)格較低，配制一套與原裝進(jìn)口試劑數(shù)量一樣的試劑，成本較原裝進(jìn)口試劑降低了88%。以飼料氨基酸檢測(cè)為例，2018年全國飼料總產(chǎn)量18 131.58萬t，2019年前三季度全國飼料總產(chǎn)量19 317.2萬t。若每500 t抽取一個(gè)檢驗(yàn)樣品，每個(gè)樣品檢驗(yàn)成本降低5元，將節(jié)省約300余萬元檢驗(yàn)成本。目前，國內(nèi)不同領(lǐng)域氨基酸檢測(cè)需求大，較低的試劑成本將帶來較大的經(jīng)濟(jì)效益。本配方用無毒害的乙醇代替硫代雙乙醇，規(guī)避了實(shí)驗(yàn)人員操作風(fēng)險(xiǎn)，降低了廢液處理成本，減輕了對(duì)環(huán)境的污染。

3 結(jié)論

本研究利用性能穩(wěn)定的LA8080高速氨基酸分析儀及國產(chǎn)化試劑測(cè)定了玉米中17種氨基酸含量，結(jié)果表明，玉米中含量最多和最少的氨基酸，分別為谷氨酸和胱氨酸。國產(chǎn)化試劑對(duì)儀器性能測(cè)試說明檢測(cè)結(jié)果是高效可靠的，各氨基酸回收率范圍為99.96%～101.42%，同時(shí)，與進(jìn)口試劑相比國產(chǎn)試劑成本降低了88%。說明此方法重現(xiàn)性好，且節(jié)約成本，是一種低成本快速測(cè)定氨基酸的理想方法。為后期大量氨基酸方面的研究提供了參考。