鄧麗嫦 吳聲振 鄔素珍 洪美華 李聰聰

1.廣東省佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院，廣東佛山 528000；2.廣東省汕尾市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東汕尾 516600

健脾利濕和胃膏是醫(yī)院協(xié)定膏方，由黨參、當(dāng)歸、陳皮、黃柏、佛手，雞內(nèi)金、丹參、薏苡仁、炒白扁豆、白芍、神曲、山藥、茯神等二十余味藥組成的中藥復(fù)方膏劑，具有健脾和胃、利濕祛暑、寧心安神、補(bǔ)氣行血的功效。本膏方針對(duì)現(xiàn)代人生活節(jié)奏快、生活工作壓力大、飲食不節(jié)、缺少鍛煉的亞健康狀況制定方藥，適用于肢體困倦、食欲不振、腹痛、腹脹、便溏、腰膝酸痛、頭暈耳鳴、頭脹、失眠等證屬脾胃虛弱、暑濕內(nèi)困的亞健康狀況人群。為了加強(qiáng)膏方質(zhì)量控制，根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部[1]通則非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查法（1105微生物計(jì)數(shù)法、1106控制菌檢查法、1107非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)）的要求，建立了健脾利濕和胃膏的微生物限度檢查法并進(jìn)行了驗(yàn)證，確保膏方微生物檢查法的準(zhǔn)確性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YX280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司），SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），BSC-1300Ⅱ2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），DT300電子天平（常熟市長(zhǎng)春儀器儀表廠），DHG-9145H鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]和黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.3 試劑

氯化鈉（分析純），試驗(yàn)中所用培養(yǎng)基購(gòu)買于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 樣品

健脾利濕和胃膏3批（廣東省佛山市禪城區(qū)中心 醫(yī) 院，批 號(hào)：20190310、20190420、20190508，規(guī)格：50g/瓶）。

2 方法與結(jié)果

2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

2.1.1 菌液制備 取分別于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基30～35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)物；取于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基20～25℃培養(yǎng)5～7d的白色念珠菌新鮮培養(yǎng)物，分別用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL≤100cfu的菌懸液。取于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基20～25℃培養(yǎng)5～7d的取黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物加入3～5mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，洗脫孢子并將菌液稀釋至每1mL≤100cfu的菌懸液。

2.1.2 供試液制備 稱取10g供試品，加入100mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，制成供試液備用（1∶10）。

2.1.3 測(cè)定方法 平皿法：平行取四份供試液（1mL/皿），其中2個(gè)平皿立即傾注15mL溫度不超過(guò)45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基混勻，另2個(gè)注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基搖勻，將以上平皿分別置30～35℃或20～25℃培養(yǎng)，需氧菌培養(yǎng)不超過(guò)3d，霉菌及酵母菌培養(yǎng)不超過(guò)5d，在3d和5d分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.1.4 回收比值測(cè)定

2.1.4.1 試驗(yàn)組 分別取1∶10的供試液各9mL，分別加入1mL含菌量≤100cfu的上述五種試驗(yàn)菌液，混勻后吸取1mL置平皿中，馬上加入15mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻。同法制備2個(gè)平皿。另取供試液9mL，分別加入白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液1mL混勻后，吸取1mL置平皿中，馬上加入15mL沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻。同法制備2個(gè)平皿。依2.1.3法培養(yǎng)后做菌落計(jì)數(shù)。

2.1.4.2 菌液組 取1mL≤100cfu的上述五種菌懸液，分別置平皿中，馬上加入15mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻。各同法制備2個(gè)平皿。另取1mL≤100cfu的白色念珠菌菌懸液、黑曲霉菌懸液，置平皿中，馬上加入15mL沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻。同法制備2個(gè)平皿。依2.1.3法培養(yǎng)后測(cè)定所加入的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.1.4.3 供試品對(duì)照組 取供試液1mL，注入平皿中，平行四份，其中2個(gè)平皿立即傾注15mL溫度不超過(guò)45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基混勻，另2個(gè)注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基搖勻。依2.1.3法培養(yǎng)后測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

2.1.5 試驗(yàn)結(jié)果 同法用平皿法驗(yàn)證樣品三批，見表1。

表1 需氧菌、霉菌和酵母菌回收比值試驗(yàn)結(jié)果（平皿法）（cfu）

計(jì)算公式為：

表1數(shù)據(jù)表明，供試品各試驗(yàn)菌的回收比值試驗(yàn)均在0.5～2，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)抑菌現(xiàn)象，符合微生物計(jì)數(shù)檢查驗(yàn)證要求。

2.2 控制菌（大腸埃希菌）計(jì)數(shù)法驗(yàn)證

2.2.1 菌液制備 取于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上30～35℃培養(yǎng)18～24h的大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋制成菌懸液（1mL≤100cfu）。

2.2.2 供試液制備 按照2.1.2供試液項(xiàng)下制備。

2.2.3 試驗(yàn)組 取10mL供試液（1∶10）和≤100cfu的大腸埃希菌菌液分別注入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100mL，混勻后于30～35℃培養(yǎng)18～24h；取1mL上述培養(yǎng)物加入100mL麥康凱液體培養(yǎng)基，混勻后于42～44℃培養(yǎng)24～48h；另劃取麥康凱液體培養(yǎng)物于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上30～35℃培養(yǎng)18～72h。

2.2.4 陽(yáng)性對(duì)照 取≤100cfu大腸埃希菌菌液加入100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其他同試驗(yàn)組。

2.2.5 陰性對(duì)照 取100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18～24h；其他同試驗(yàn)組。

2.2.6 試驗(yàn)結(jié)果 同法驗(yàn)證三個(gè)批次，見表2。

表2數(shù)據(jù)表明供試品采用常規(guī)法控制菌能正常檢出，陰性對(duì)照未檢出，在實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)抑菌現(xiàn)象，符合控制菌檢查驗(yàn)證要求。

表2 大腸埃希菌計(jì)數(shù)法驗(yàn)證結(jié)果（常規(guī)法）

上述方法驗(yàn)證結(jié)果表明健脾利濕和胃膏可按平皿法進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查，按常規(guī)法進(jìn)行控制菌（大腸埃希菌）的檢查。

3 討論

2015年版《中國(guó)藥典》四部的微生物限度檢查法進(jìn)一步完善了2010年版的方法并接軌國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)，保障了微生物角度控制非無(wú)菌制劑的安全性和有效性[2]。按照《中國(guó)藥典》四部的要求，中成藥、醫(yī)院制劑微生物檢驗(yàn)方法應(yīng)該按照藥典規(guī)定完成方法學(xué)驗(yàn)證后進(jìn)行檢驗(yàn)。 嚴(yán)曉明等[3-7]對(duì)醫(yī)院制劑進(jìn)行了微生物限度檢查學(xué)的方法驗(yàn)證，趙會(huì)蘭等[8-14]對(duì)中成藥進(jìn)行了微生物限度檢查學(xué)的方法驗(yàn)證，確保方法的完整性和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，證明了一廠、一品、一規(guī)的藥物微生物限度檢查法在生產(chǎn)工藝變更、組方成分改變、檢查法修訂或檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，也應(yīng)重新進(jìn)行方法學(xué)的驗(yàn)證[15-16]。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明平皿法檢查健脾利濕和胃膏的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)，6種陽(yáng)性對(duì)照菌的回收比值均在0.5～2；常規(guī)法檢查控制菌（大腸埃希菌），實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用。因此，可采用平皿法進(jìn)行健脾利濕和胃膏的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查，常規(guī)法進(jìn)行控制菌（大腸埃希菌）的檢查。實(shí)驗(yàn)中采用6種陽(yáng)性對(duì)照菌的回收比值試驗(yàn)確保了方法的準(zhǔn)確性，方法適宜、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好，可作為健脾利濕和胃膏的微生物質(zhì)量控制方法。