（南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 南通 226006）

糖皮質(zhì)激素是一類母核為環(huán)戊烷駢多氫菲結(jié)構(gòu)的甾體激素，具有抗炎、抗過敏、抗休克和免疫抑制等藥理作用，是臨床皮膚科領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的外用藥物之一[1]。但長期使用糖皮質(zhì)激素會(huì)產(chǎn)生激素依賴癥及其他副作用，甚至引發(fā)癌癥，對(duì)人體造成嚴(yán)重傷害。我國的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）和歐盟化妝品法規(guī)中均明確規(guī)定化妝品中不得添加任何激素類藥物[2]。但因糖皮質(zhì)激素對(duì)皮膚具有顯著的消炎祛痘、美白護(hù)膚功效，部分商家依然將其非法添加到化妝品中，以謀取不當(dāng)利益[3]。消費(fèi)者長期使用這類化妝品，其中激素類藥物會(huì)通過皮膚吸收進(jìn)入人體，對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成嚴(yán)重影響[3-4]。

近年檢測化妝品中糖皮質(zhì)激素的方法主要有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜-高分辨質(zhì)譜法。質(zhì)譜法具有選擇性好、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，目前已成為最主要的檢測手段[5]。與串聯(lián)質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜具有更強(qiáng)的定性能力和更高的靈敏度，但儀器成本高、普及率低。因此，對(duì)于大多數(shù)檢測機(jī)構(gòu)而言，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法更為適用。此外，已報(bào)道的方法大多采用固相萃取凈化樣品，方法耗時(shí)，成本高，且難以實(shí)現(xiàn)大批量樣品的同時(shí)處理[6-8]。本研究通過優(yōu)化樣品前處理方法和色譜-質(zhì)譜條件，建立了液相色譜-質(zhì)譜同時(shí)快速測定膏霜類化妝品中41種糖皮質(zhì)激素的分析方法。該方法可為化妝品中糖皮質(zhì)激素的高通量分析提供技術(shù)支持，能極大地提高化妝品安全風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)控水平。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Vanquish-F高效液相色譜儀（美國Thermo Scientific公司）；TSQALTIS質(zhì)譜儀（美國Thermo Scientific公司）；BSA224S電子天平（德國Sartorius公司）；MIKRO 220R離心機(jī)（德國Hettich公司）；HN22-500A超聲波提取器（上海汗諾儀器有限公司）；Xcelvap氮吹濃縮儀（美國Horizon公司）。

1.2 試藥

曲安西龍（批號(hào)：FS1607684），40種糖皮質(zhì)激素混標(biāo)（批號(hào)：S018441，美國 A Chemtek Inc公司）；甲醇，乙腈（色譜純，美國Merck公司）；乙酸（色譜純，美國Sigma公司）；其余試劑為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。30批次膏霜類化妝品購自本市各美容院和小商品批發(fā)市場。

2 方法

2.1 色譜條件

Thermo Hypersil GOLD 色譜柱（100 mm×2.1mm，1.7 μm），流動(dòng)相：0.1 %乙酸水溶液（A）-0.1 %乙酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，68 %A；6～20 min，68 %A～25% A；20～22 min，25 %A；22～22.1 min，25 %～68 %A；22.1～25 min，68 %A），流速：0.3 ml/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量：2 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；電壓3500 V；離子源溫度320 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；鞘氣壓力35 Arb；輔助氣壓力5 Arb；采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM參數(shù)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取對(duì)照品曲安西龍2 mg，置入20 ml棕色量瓶，用甲醇溶解，并定容至刻度，配制成100 μg/ml儲(chǔ)備液。分別移取100 μl曲安西龍儲(chǔ)備液及40種糖皮質(zhì)混標(biāo)（100 μg/ml），置入10 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，稀釋成濃度為1 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.4 樣品前處理

稱取1 g樣品，置入50 ml離心管，分別加入5 ml飽和氯化鈉溶液和5 ml正己烷，于渦旋混合器上混合使樣品分散，準(zhǔn)確加入10 ml乙腈，充分渦旋2 min，超聲20 min，4 ℃下以10 000 r/min離心5 min，用針抽取中間層澄清液，轉(zhuǎn)移至氮吹管中，40 ℃下氮吹至近干，用1 ml乙腈溶解，渦旋1 min，過0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品的提取

膏霜類化妝品基質(zhì)較為復(fù)雜，需選擇合適的提取溶劑。本實(shí)驗(yàn)選擇丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑，系統(tǒng)地比較了這幾種提取溶劑的提取效率。經(jīng)比較，丙酮對(duì)膏霜類化妝品中常用基質(zhì)如油脂類、蠟類及組成這些成分的高級(jí)脂肪酸、高級(jí)醇類物質(zhì)有很強(qiáng)的溶解能力[9]，因此，采用丙酮提取化妝品中糖皮質(zhì)類激素，將會(huì)在提取液中帶入過多的雜質(zhì)，對(duì)色譜柱及儀器造成損害；以甲醇為提取溶劑時(shí)，甲醇和水無法分層，溶液較為渾濁，造成過濾困難；以乙腈和乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)，在加入鹽的情況下，乙腈和乙酸乙酯均能和水分層，但乙酸乙酯和正己烷互溶[10]，因此無法實(shí)現(xiàn)加入正己烷以進(jìn)一步除去雜質(zhì)的目的。因此，選擇乙腈為提取溶劑。另外，在加入提取劑乙腈之前，加入飽和氯化鈉和正己烷，能去除樣品基質(zhì)中極性強(qiáng)的雜質(zhì)（溶于水相）及非極性和部分弱極性的雜質(zhì)（溶于正己烷相）[11]，達(dá)到較好的凈化效果。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈、飽和氯化鈉、正己烷三相溶劑體系，樣品能得到較好的快速提取與凈化。

3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

分別考察了水-乙腈，0.1 %乙酸水溶液-乙腈，0.1 %乙酸水溶液-0.1 %乙酸乙腈溶液3種流動(dòng)相體系梯度洗脫，結(jié)果顯示，在流動(dòng)相中加入少量乙酸，有利于化合物離子化，提高靈敏度，以0.1 %乙酸水溶液-0.1 %乙酸乙腈溶液為流動(dòng)相質(zhì)譜響應(yīng)最好，梯度洗脫可得到良好的分離效果和峰形。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

糖皮質(zhì)激素是具有甾醇母核的一類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，分離具有一定的難度。由于41種待測化合物均在正離子模式下有較強(qiáng)的質(zhì)譜響應(yīng)，因此選擇正離子掃描模式。通過對(duì)電壓、碰撞能量、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、碰撞氣壓力等一系列質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的質(zhì)譜條件。最終在MRM模式下，使結(jié)構(gòu)性質(zhì)相近的上述各化合物能達(dá)到較好地分離，各通道之間無明顯干擾，使從膏霜類化妝品中快速提取檢測41種可能的非法添加化合物的方法成為可能。41種糖皮質(zhì)激素的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 41種糖皮質(zhì)激素的提取離子色譜圖

3.4 專屬性試驗(yàn)

分別考察了混合對(duì)照品工作液、陰性空白溶液和供試品溶液（氫化可的松、曲安奈德、氟米龍醋酸酯、倍氯米松雙丙酸酯陽性樣品）的色譜圖。結(jié)果顯示，陰性空白樣品的主要色譜峰在1 min之前，對(duì)41種糖皮質(zhì)激素的篩查不存在干擾，典型色譜圖見圖2。有部分色譜峰保留時(shí)間較為接近，部分重合，尤其在4～5 min和14～15 min 之間，對(duì)于這幾種成分的疑似陽性樣品可通過超高效液相色譜-四極桿-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行確認(rèn)。

3.5 線性關(guān)系、檢出限和定量限

圖2 專屬性色譜圖

用空白基質(zhì)配制6個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（1～200 μg/L），在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下測定。以各化合物定量監(jiān)測離子對(duì)色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程和相關(guān)系數(shù)（r）。結(jié)果表明 41種化合物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰峰面積均呈良好的線性關(guān)系，r均大于0.99。在空白基質(zhì)中添加一定濃度的41種糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍信噪比和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度分別作為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，這41種待測物的LOD和LOQ分別為1～2 μg/kg和3～7 μg/kg。

3.6 回收率和精密度

在空白基質(zhì)中添加41種糖皮質(zhì)激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為10，20，100 μg/kg，每個(gè)添加水平平行測定6次，計(jì)算每個(gè)待測物的平均回收率和RSD，見表2。結(jié)果顯示，方法的平均回收率為73.8 %～104.6 %（n=6），RSD為3.6 %～9.7 %（n=6）。

表2 41種糖皮質(zhì)激素線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD、LOQ、精密度及回收率

33 哈西奈德 y=2.963×105x+6.627×104 0.9993 1 3 8.4，7.9，5.7 89.7，92.8，94.4 34 阿氯米松雙丙酸酯 y=5×104x+3.174×104 0.9980 2 7 4.9，5.4，4.3 86.9，92.5，94.6 35 安西奈德 y=5.509×104x-2.054×104 0.9953 2 7 4.6，3.2，3.9 75.8，87.4，93.8 36 氯倍他索丙酸酯 y=7.273×105x+8.492×104 0.9981 1 3 8.8，7.1，5.3 83.7，92.7，97.9 37 氟替卡松丙酸酯 y=3.058×104x+1.019×104 0.9964 2 7 9.2，6.9，5.3 84.7，92.6，101.8 38 莫米他松糠酸酯 y=6.321×104x-2.319×104 0.9986 2 7 6.2，5.4，4.7 80.3，89.7，97.5 39 倍他米松雙丙酸酯 y=1.125×105x-2.259×104 0.9983 1 3 9.7，6.8，5.2 81.5，89.4，92.6 40 倍氯米松雙丙酸酯 y=1.912×105x+1.742×105 0.9994 1 3 6.7，7.2，5.7 76.2，86.9，94.3 41 倍氯他松丁酸酯 y=4.432×104x+2.999×104 0.9975 2 7 5.4，4.6，3.6 83.4，90.5，97.5

3.7 方法應(yīng)用

利用本方法對(duì)購買的30批次的膏霜類化妝品進(jìn)行篩查分析，在兩個(gè)批次樣品中檢出違禁添加的糖皮質(zhì)激素，分別為倍他米松247 μg/kg，曲安奈德醋酸酯428 μg/kg。利用國標(biāo)GB/T24800.2-2009 方法[12]同時(shí)對(duì)這30批次樣品進(jìn)行測定，檢出結(jié)果與本方法一致，檢出的含量為倍他米松269 μg/kg，曲安奈德醋酸酯403 μg/kg，與本方法測定的含量差異較小。由此可見，利用本方法對(duì)膏霜類化妝品中糖皮質(zhì)激素進(jìn)行篩查和定量是可行的。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜-四極桿-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)膏霜類化妝品中的41種糖皮質(zhì)激素物質(zhì)進(jìn)行篩查，在25 min內(nèi)完成了對(duì)41種糖皮質(zhì)激素較好的分離，該方法前處理簡便、抗干擾性強(qiáng)，靈敏度高，可為批量快速檢測膏霜類化妝品中糖皮質(zhì)激素提供方法參考和數(shù)據(jù)支持。