李 霞，楊海霞，趙國敏，袁曉如

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點實驗室，山東 濟(jì)南 250101）

1 分光光度法

分光光度法包括N-甲基葡萄糖胺法（Elson-Morgan法）、Indol-Hcl法、茚三酮法、4-氨基-5-肼基-4H[1,2,4]-三唑-3-硫醇法（AHTT法）和京尼平法。

1.1 N-甲基葡萄糖胺法

用于測定游離的氨基糖，是GAH含量測定的常用方法，其原理是：GAH中的2-甲基葡糖胺在堿性條件下，與乙酰丙酮縮合，生成的色原與對二甲氨基苯甲醛在酸性條件下結(jié)合呈紅色，在525 nm左右波長處測定吸光度。翟詠紅等[4]用該法測定了復(fù)方制劑真靈活膠囊中GAH的含量，且另一成分硫酸軟骨素對GAH測定無干擾。馮傳平[5]用該法測定了氨基葡萄糖枸櫞酸鈣分散片中GAH的含量，枸櫞酸鈣與輔料均無干擾。許創(chuàng)偉等[6]由預(yù)處理后的蝦殼制備幾丁質(zhì)，用鹽酸水解得D-GAH，優(yōu)化水解工藝確定最佳工藝條件：水解鹽酸濃度11.7 mol/L，水解溫度95 ℃，水解時間4 h，采用紫外分光光度法，在420 nm處測定樣品中D-GAH的含量。

1.2 Indol-Hcl法

將過量亞硝酸與氨基己糖反應(yīng)，脫氨基同時脫水，生成2, 5-己糖酐，與酸性的吲哚乙醇絡(luò)合生成桔紅色產(chǎn)物，在492 nm波長處測定吸光度。王維等[7]用該法測定了GAH的含量，并與Elson-Morgan法進(jìn)行比較，結(jié)果表明Indol-Hcl法重現(xiàn)性較Elson-Morgan法好，且條件易于控制，對于成品的測定，用Indol-Hcl法精度高，但測定含抗壞血酸等雜質(zhì)的D-GAH時，采用Elson-Morgan法雜質(zhì)無干擾，精度更高。

1.3 茚三酮法

GAH與茚三酮反應(yīng)后，溶液呈紫色，在570 nm波長處測定吸光度。Wu 等[8]用該法測定了GAH緩釋片中GAH的含量，研究了茚三酮濃度、反應(yīng)時間、pH值、反應(yīng)溫度、紫色穩(wěn)定期和葡萄糖胺/茚三酮比對檢測結(jié)果的影響，優(yōu)化了測定方法。

1.4 AHTT法

GAH被高碘酸氧化產(chǎn)生甲醛，與AHTT縮合后進(jìn)一步氧化生成紫色化合物，在550 nm波長處測定吸光度。Abdullah等[9]用該法測定了藥品中GAH的含量，在0.02～0.18 μg/ml范圍內(nèi)遵守比爾定律，該法比Elson-Morgan法準(zhǔn)確率高70多倍。

1.5 京尼平法

利用京尼平與氨基發(fā)生顯色反應(yīng)，在590 nm波長處測定吸光度。何思蓓等[10]用京尼平顯色測定GAH含量，結(jié)果表明GAH含量測定的檢測波長為590 nm，在80 ℃和pH 8～11條件下，反應(yīng)時間2 h，產(chǎn)物顯色性質(zhì)穩(wěn)定，該法與Elson-Morgan法無顯著差別，可用于實驗室簡便測定。

分光光度法是測定GAH的常用方法，該法專屬性強(qiáng)，靈敏度較高，但操作過程復(fù)雜，影響顯色的因素較多，重現(xiàn)性較差，操作時注意精密操作以減小誤差。

2 色譜法

色譜法包括高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、高效薄層色譜法（HPTLC）、毛細(xì)管電泳法、液質(zhì)聯(lián)用法和離子色譜法6種方法。

試劑：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽藥粉(湖北荊洪生物科技股份有限公司生產(chǎn))，溶劑包括甲醇(AR級，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))、二甲基甲酰胺(DMF，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))及醋酸仲丁酯(AR級，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))，乳化劑包括蓖麻油聚氧乙烯醚(BY-125，邢臺藍(lán)天精細(xì)化工股份有限公司生產(chǎn))、苯乙基酚聚氧乙烯醚(600號， 邢臺藍(lán)天精細(xì)化工股份有限公司生產(chǎn))、有機(jī)硅(自制)和7211(自制)．

2.1 HPLC

2.1.1 不經(jīng)衍生直接測定

2.1.1.1 HPLC-紫外檢測法 羅立等[11]用HPLC測定了GAH及其制劑，檢測波長為195 nm，氨基柱HPLC普適性、耐用性良好，能將氯離子與GAH完全分離，采用常規(guī)的紫外檢測器，可滿足生產(chǎn)企業(yè)現(xiàn)有的檢測技術(shù)水平。Kosman等[12]采用HPLC，檢測波長為 195 nm，考察了在水及不同pH（1.2，4.5和6.8）溶出介質(zhì)中GAH硫酸軟骨素復(fù)方片的溶出度。

2.1.1.2 HPLC-二極管陣列檢測法 張潔等[13]采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）測定GAH。采用二極管陣列檢測器，利用親水作用較強(qiáng)的色譜柱，避免目標(biāo)峰周圍出現(xiàn)負(fù)峰、與雜質(zhì)峰分離不好和目標(biāo)物不保留的問題。沈丹丹等[14]采用Phenomenex Luna NH2色譜柱，以磷酸鹽緩沖液-乙腈（25:75）為流動相，流速為1.5 ml/min，柱溫30 ℃，檢測波長195 nm，測定了不同廠家GAH制劑的含量及有關(guān)物質(zhì)。

2.1.1.3 HPLC-蒸發(fā)光檢測法 宮艷艷等[15]應(yīng)用HPLC-蒸發(fā)光法，測定了保健品中GAH的含量，采用Waters Xbridge Amide柱，蒸發(fā)光散射檢測器，檢測條件為漂移管溫度105 ℃，載氣N2，壓力12.5 bar。王太亮等[16]采用HPLC-蒸發(fā)光散射檢測法測定了氨糖美辛腸溶膠囊中GAH的含量，采用Inertsil C8色譜柱，以乙腈-水（70:30）為流動相，流速為1.0 ml/min，柱溫為25 ℃。楊淮等[17]采用HPLC-蒸發(fā)光散射檢測法測定了GAH膠囊的含量，使用氨基色譜柱，以乙腈-水（70:30）為流動相，流速為1.0 ml/min。

2.1.1.4 HPLC-示差折光檢測法 姜紅等[18]用HPLC-示差折光法測定GAH含量，采用NH2色譜柱，以磷酸銨緩沖液-乙腈（45:55）為流動相，流速為0.6 ml/min，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考，適合于GAH類藥物的質(zhì)量控制。

2.1.2 衍生后測定 朱志靈等[19]采用RP-HPLC柱前衍生化法測定殼聚糖噴霧劑中GAH的含量，采用Kromasil C18色譜柱，以乙腈-0.05 %磷酸鹽緩沖液為流動相，梯度洗脫，流速為0.6 ml/min，衍生化后產(chǎn)生的兩個異構(gòu)體均達(dá)到良好分離。王英瑛等[20]將芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺（FMOC-OSu）加入GAH溶液，在三乙胺存在的堿性條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)，衍生后用HPLC在265 nm波長處測定。采用該法測定了原料藥、片劑及氨基葡萄糖硫酸鈉鹽膠囊中GAH含量。Zhu等[21]采用氯甲酸芴甲酯（FMOCCl）對幾丁質(zhì)水解產(chǎn)生的GAH進(jìn)行衍生化后，用HPLC在254 nm波長處測定了GAH含量，該法還可用于測定原料及食品中幾丁質(zhì)的純度。王德偉等[22]用RP-HPLC柱前在線衍生法在340 nm波長處測定了保健品中氨基葡萄糖硫酸鉀鹽的含量，利用鄰苯二甲醛衍生試劑與氨基葡萄糖硫酸鉀鹽中的氨基進(jìn)行柱前在線衍生化反應(yīng)，解決了GAH在反相柱上保留時間短，難與雜質(zhì)分離的缺點。

2.2 GC

李俊等[23]以1-甲基咪唑為溶劑和催化劑，以鹽酸羥胺和乙酸酐為肟化和乙?；噭?，對GAH片進(jìn)行衍生化，以甘露醇為內(nèi)標(biāo)，用衍生化GC測定了GAH的含量。

2.3 HPTLC

Sullivan等[24]將GAH在硅膠板上展開，噴茚三酮后置可見燈下檢視，測定了營養(yǎng)品中GAH含量。Esters等[25]將樣品在F254硅膠薄層板上展開后，浸入改良香草醛試液中，加熱后顯棕紅色斑點，在415 nm波長處測定了含中草藥成分的營養(yǎng)品中GAH含量。

2.4 毛細(xì)管電泳法

Qi 等[26]用毛細(xì)管電泳法將GAH、氨基半乳糖、N-甲基葡糖胺、N-乙酰氨基葡糖及氨基葡萄糖醛酸等氨基糖分離。分離后的氨基糖經(jīng)微波消解丹?；笤?14 nm波長處進(jìn)行在線紫外吸收檢測。張佳蕊等[27]建立了毛細(xì)管電泳間接紫外檢測法測定GAH的含量，背景電解質(zhì)溶液為60 mmol/L吡啶二羧酸-0.3 mmol/L十六烷基三甲基溴化銨，pH值為12.30。

2.5 液質(zhì)聯(lián)用法

張華珺等[28]建立了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）測定GAH的含量，優(yōu)化液相色譜條件，選擇CAPCELL PAK CR 1:4色譜柱，流動相為乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液（含0.1 %醋酸）=1:1，流速為0.3 ml/min，采用正離子檢測，選擇反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行定性定量。李鵬飛等[29]采用LC-MS/MS測定人血漿中GAH的濃度，色譜柱選用Agilent TCC18，流動相為乙腈-0.01 %氨水，梯度洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測。Roda 等[30]將血漿用三氯乙酸沉淀蛋白后，用高效液相色譜-電噴霧離子化質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-ESI-MS）間接測定了人血漿中GAH含量，使用聚合物基質(zhì)氨基高效液相色譜柱和水-乙腈流動相梯度洗脫，用MS進(jìn)行檢測，使用電噴霧源并采用多反應(yīng)監(jiān)測，分別監(jiān)測葡萄糖胺和內(nèi)標(biāo)物。Zhong等[31]也用HPLC-ESI-MS法測定了人血漿中GAH含量，將血漿蛋白質(zhì)沉淀后，在Inertsil CN-3色譜柱上等度洗脫，采用MS，多反應(yīng)監(jiān)測模式下檢測，m/z為180/72，將分析時間大大縮短，提高了工作效率。

2.6 離子色譜法

豐航等[32]利用GAH和維生素C的電導(dǎo)性質(zhì)，采用離子色譜法對其進(jìn)行分離，借助電導(dǎo)檢測器同時進(jìn)行二者的含量測定。戰(zhàn)英等[33]用陰離子色譜法測定了保健食品中的GAH，該法操作簡單，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度及重復(fù)性良好，但是測定時色譜柱易受有機(jī)物污染，色譜柱耐受性差，可為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

GAH無特征吸收，HPLC直接測定時采用末端吸收處波長或特殊色譜柱，受流動相、儀器穩(wěn)定性、色譜柱填料穩(wěn)定性等因素影響較大；采用HPLC-蒸發(fā)光檢測法、HPLC-示差折光檢測法時方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)；采用衍生后HPLC測定，有特征吸收，準(zhǔn)確度高，但是衍生操作較繁瑣；衍生化GC專屬性較好，但衍生化操作步驟繁瑣；薄層色譜法及毛細(xì)管電泳法操作步驟均較多，影響因素多，操作重復(fù)性較差；液質(zhì)聯(lián)用法快速、靈敏、高效，適用于低濃度樣品的測定。

3 旋光度法

GAH具有光學(xué)活性，平面偏振光通過其溶液時，能引起旋光現(xiàn)象，使偏振光的平面向左或向右旋轉(zhuǎn)，即為旋光度?？衫眠@一性質(zhì)測定GAH的含量。莊旭琴[34]采用旋光度法測定了GAH片的含量，濃度與旋光度之間有良好線性關(guān)系，回收率好。旋光度法靈敏、準(zhǔn)確、操作簡單，但對溫度要求高，需要在特定溫度下操作。

4 滴定法

將D-GAH溶于75 %乙醇溶液中，以麝香草酚蘭為指示劑，用乙醇鉀溶液滴定至終點時，溶液呈亮藍(lán)色，根據(jù)乙醇鉀消耗體積，計算GAH的含量。陳金東等[35]用該法測定了保健食品中GAH的含量。駱治瓊[36]用滴定分析法和分光光度法測定保健食品中D-GAH的含量，對于兩種方法的回收率、精密度及檢測結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果無顯著差異，且能實現(xiàn)自動化檢測。滴定法簡便、快捷，適于含量較高的樣品中GAH的測定測定，使用自動電位滴定儀重復(fù)性更好。

5 結(jié)語

GAH及其制劑在多個領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，其含量測定方法有多種。隨著新方法新技術(shù)的產(chǎn)生，基于不同的測定原理，GAH的含量測定方法越來越多樣，選擇GAH含量測定方法時應(yīng)根據(jù)樣品的具體特點選擇合適的測定方法。