曾 羲，戚 平，汪 寧，林子豪，錢(qián)振杰，周慶瓊，蔡偉誼，彭名軍

（廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 511400）

0 引言

保健食品是指具有特定保健功能或以補(bǔ)充維生素、礦物質(zhì)為目的的食品[1]。近年來(lái)，傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，保健食品比藥品更安全、更健康且無(wú)副作用，口服液類(lèi)保健食品也因其食用方便、吸收率高等優(yōu)勢(shì)備受消費(fèi)者青睞，使得保健品行業(yè)呈現(xiàn)出飛速發(fā)展的態(tài)勢(shì)[2]。目前，我國(guó)批準(zhǔn)的保健食品功能有27 種[3]，其中降壓類(lèi)和壯陽(yáng)抗疲勞類(lèi)保健食品對(duì)消費(fèi)者的吸引力較大，且添加的可能性也較大[4-5]。一些商家為牟取暴利，在保健食品中添加目的性藥物，以達(dá)到見(jiàn)效快的目的，從而增加了保健食品的安全隱患[6-9]。

近年來(lái)，保健食品中非法添加藥物常用的方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、超高效液相色譜法[6，11]、（超） 高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[9，12-13]、QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、超高液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中，氣質(zhì)法需要衍生化處理，較繁瑣費(fèi)時(shí)；液相法對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的樣品定性時(shí)易出現(xiàn)假陽(yáng)性；液相質(zhì)譜法的掃描方式選擇性強(qiáng)、靈敏度高、定量及定性能力強(qiáng)，可以檢測(cè)出多組分超低含量的化合物。

基于近年來(lái)保健食品中易檢出的項(xiàng)目，選擇了22 種降壓類(lèi)和壯陽(yáng)抗疲勞類(lèi)非法添加藥物，綜合檢測(cè)成本、提取效率和同分異構(gòu)體分離鑒定等因素，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)口服液保健食品中非法添加的22 種降壓類(lèi)和壯陽(yáng)抗疲勞藥物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

口服液保健食品，購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；實(shí)驗(yàn)室用22 種藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度均大于98%），北京振翔科技有限公司提供；乙腈和甲醇（色譜純），美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司提供；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水；其他化學(xué)試劑均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠提供。

1.2 儀器與設(shè)備

API4000 型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)ABSCIEX 公司產(chǎn)品；2600TH 型超聲清洗器，上海安譜科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SECURA224-1CN 型電子天平，美國(guó)Sartorious 公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

（1） 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱(chēng)取上述標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇振蕩溶解，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃下避光密封貯存。分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量用甲醇定容，使用前用樣品基質(zhì)提取液稀釋成6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度的工作液。工作液的標(biāo)曲范圍為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0 ng/mL。

（2） 樣品溶液的配制。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 0 g 樣品于50 mL 容量瓶中，加入約40 mL 甲醇- 水溶液（50∶50，V/V），超聲提取10 min，取出冷卻至室溫后，再定容至50 mL，過(guò)0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜后待測(cè)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Thermo Accucore aQ C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.1%甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～1.5 min，90% B；1.6～3.0 min，90%～65% B；3.1～8.0 min，65%～10% B；8.1～9.0 min，10% B；9.1～10.0 min，90% B。柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.3 mL/min。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子（ESI+） 源，噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度550 ℃，霧化氣壓0.38 MPa，輔助加熱氣壓0.38 MPa，氣簾氣0.17 MPa。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）質(zhì)譜。

22 種非法添加違禁藥物的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 22 種非法添加違禁藥物的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

由于目標(biāo)化合物的數(shù)量較多，故選用較長(zhǎng)的Thermo Accucore aQ C18（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）柱進(jìn)行分離。分別考查了以0.1% 甲酸（V/V）-10 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈、10 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈、0.1% 甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇和10 mmol/L 乙酸銨水溶液-甲醇等4 種體系作為流動(dòng)相，觀察各流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明，0.1% 甲酸（V/V） -10 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，各目標(biāo)化合物的響應(yīng)均較優(yōu)，且檢測(cè)靈敏度和離子化效率最高。

目標(biāo)化合物阿替洛爾的極性較大，保留時(shí)間較短，故0～3 min 采用較高比例的水相延緩出峰時(shí)間，3～8 min 不斷提高有機(jī)相的比例能較好地分離出其他21 種化合物，且同分異構(gòu)體（羥基豪莫西地那非和代艾地那非、豪莫西地那非和伐地那非、偽伐地那非和那莫西地那非） 均能夠較好地分離。故綜合以上因素得到1.3.2 中的色譜條件。

22 種化合物的總離子色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別將22 種非法添加物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL） 用甲醇稀釋成100 ng/mL 的對(duì)照液，在正離子模式下，直接推針進(jìn)樣，優(yōu)化質(zhì)譜條件。發(fā)現(xiàn)22 種目標(biāo)化合物在正離子模式下均有較好響應(yīng)。確定母離子后，用子離子掃描方式選擇相對(duì)離子豐度高的2 個(gè)作為二級(jí)碎片離子。在這22 種藥物中，有3 組同分異構(gòu)體，分別為羥基豪莫西地那非和硫代艾地那非、豪莫西地那非和伐地那非、偽伐地那非和那莫西地那非，對(duì)二級(jí)碎片離子進(jìn)行比對(duì)分析，通過(guò)不同的出峰時(shí)間，結(jié)合選擇不同子離子分析鑒別，最終得到1.3.3 中的質(zhì)譜條件。

圖1 22 種化合物的總離子色譜圖

2.3 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

參考胡青等人的研究結(jié)論，用純甲醇為提取溶劑，并優(yōu)化提取條件，采用甲醇-水（50∶50，V/V）作為提取溶劑。

2 種提取溶劑的提取回收率比較見(jiàn)圖2。

圖2 2 種提取溶劑的提取回收率比較

由圖2 可知，甲醇為提取溶劑時(shí)，有3 種化合物的提取回收率低于80%，且利血平的提取回收率僅有50%，其可能原因是利血平極易溶于水不溶于甲醇。當(dāng)采用甲醇-水（50∶50，V/V） 作為提取溶劑時(shí)，各目標(biāo)化合物的提取回收率均在80%～120%，利血平的提取回收率顯著增加。因此，以甲醇-水（50∶50，V/V） 為提取溶劑。

比較了不同超聲時(shí)間（5，10，15 min） 對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。從不同超聲時(shí)間的提取回收率看，超聲時(shí)間在10，15 min 時(shí)，22 種目標(biāo)化合物的提取效率均介于80%～120%，當(dāng)超聲時(shí)間為5 min 時(shí)，有6 種目標(biāo)化合物的提取回收率在80%以下。故在進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證和實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，選用超聲時(shí)間為10 min。

超聲時(shí)間的提取回收率比較見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間的提取回收率比較

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限的測(cè)定

按1.3.1 中標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制方法，在1.3.2 和1.3.3 儀器條件下，依次進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行分析，在1.0～50.0 ng/mL 線性范圍內(nèi)，以目標(biāo)化合物的峰面積為縱坐標(biāo)（y），以質(zhì)量濃度（x，ng/mL） 為橫坐標(biāo)，通過(guò)Multiquant 軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，根據(jù)3 倍信噪比（S/N=3） 和10 倍信噪比（S/N=10） 分別計(jì)算檢出限（LOD） 和定量限（LQD），各種目標(biāo)化合物在線性范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)（r） 均大于0.99。

2.4.2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)及精密度

對(duì)經(jīng)檢測(cè)不含非法添加化學(xué)藥物的空白樣品（紅牛維生素功能飲料） 進(jìn)行加標(biāo)回收率的試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)。于空白樣品中添加低（0.1 μg/g）、中（0.5 μg/g） 和高（1.0 μg/g） 3 個(gè)水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3 中方法進(jìn)行樣品前處理，取6 次試驗(yàn)結(jié)果的平均值計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度。

22 種非法添加違禁藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6） 見(jiàn)表2。

22 種非法添加化學(xué)藥物的回收率介于77.15%～117.62%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為0.05%～10.65%（n=6），滿足日常檢測(cè)的要求。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

在市場(chǎng)隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)專(zhuān)項(xiàng)保健食品10 種，利用該方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中一款壯陽(yáng)類(lèi)液體保健食品中紅地那非和西地那非有較低劑量檢出，含量分別為0.073 μg/g 和0.10 μg/g?？梢?jiàn)保健食品市場(chǎng)非法添加現(xiàn)象較為普遍，市場(chǎng)監(jiān)督管理局應(yīng)予以高度重視。

3 結(jié)論

采用甲醇-水超聲提取，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定液體保健食品中22 種非法添加的違禁藥物。該方法前處理簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短，檢出限、精密度和回收率均能滿足實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)工作，在快速、準(zhǔn)確地對(duì)保健品中常見(jiàn)的降壓藥和壯陽(yáng)抗疲勞類(lèi)等非法添加藥物進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，大大提高了日常檢驗(yàn)的工作效率，為加強(qiáng)保健食品市場(chǎng)的監(jiān)管和檢驗(yàn)提供了重要的技術(shù)支撐。

表2 22 種非法添加違禁藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）