鄒桃

【摘要】目的：下調(diào)或者降低CSE的含量來研究對于乳腺癌細胞MCF-7的生長增殖影響。方法：MCF-7轉(zhuǎn)染siRNA，western-blot的方法來檢測細胞表達量，將獲得的實驗組和對照組的蛋白含量的灰度值比較，從而確定CSE含量是否得到下調(diào)。MTT實驗分別檢測對照組和實驗組細胞生長活力的差異。從而確定CSE下調(diào)是否抑制細胞生長。然后通過細胞周期檢測來獲得細胞的生長增殖情況。結(jié)果：siRNA使CSE表達減少，MTT顯示實驗組明顯比對照組細胞活力有所降低，差異顯著性分別為p<0.01，p<0.05，細胞周期檢測結(jié)果顯示CSE下調(diào)明顯抑制MCF-7增殖，使細胞生長周期阻滯在s期，與對照組比較有顯著差異性。實驗結(jié)論：通過轉(zhuǎn)染siRNA的方法使乳腺癌細胞中CSE含量減少，并且CSE的下調(diào)明顯抑制了細胞的生長和增殖。

【關(guān)鍵詞】CSE? MCF-7? 乳腺癌細胞 生長增殖

一、緒論

（1）乳腺癌目前研究。目前乳腺癌前病變機理的研究，從分子水平上對癌癥的研究漸漸成為熱點。腫瘤標志物越來越成熟，可用來研究更多的新的原癌基因、抑癌基因，研究細胞凋亡基因和信號傳導基因等，來了解乳腺癌細胞治療的方法和突破點，而有利于早期的診斷、早期的預防治療和后期的復檢，方便臨床對乳腺癌進行具體分析具體分析。并且采取合理有效的措施。

（2）CSE與硫化氫。最近研究表明硫化氫由胱硫醚β合成酶（CBS），胱硫醚γ裂解酶CSE和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶催化生成，CBS和CSE在細胞漿內(nèi)生成硫化氫是以L-半胱氨酸作為底物。由此我們可以聯(lián)想到從CSE的層面，來降低硫化氫的表達量，就會對細胞的生長和增殖起到一定的作用。

二、實驗方法

（一）MCF-7細胞培養(yǎng)

含10 %血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

（二）western-blot檢測對照組和經(jīng)過轉(zhuǎn)染后乳腺癌細胞中CSE表達量及相應(yīng)細胞活力檢測

（1）細胞種板和轉(zhuǎn)染種六孔板，細胞密度30%-50%，第二天，每孔轉(zhuǎn)染方式如下：a將20pmolsiRNA溶于50ul1640無血清培養(yǎng)基中。b將1ul lip2000溶于50ul無血清1640培養(yǎng)基中，輕彈混勻室溫放置5min。c，將a、b兩管混合，混勻后放置20min。轉(zhuǎn)染期間，將6孔板中的培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，每孔400ul。將c管混勻加入6孔板其中一孔中，另一個孔中加入scRNA，4-6小時換成有血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h。

（2）提取蛋白和wetern-blot：分別收集處于對數(shù)生長期的對照組和轉(zhuǎn)染siRNA的MCF-7細胞;用離心機3500rpm 5min離心，棄上清;向加入1mlpbs，吹勻，移到EP管中，3000rpm 5min;將Ep管中的上清液棄去;離心管加入RIPA和PMSF（100：1）細胞裂解液， 冰上裂解30 min;裂解完后，用12000rpm，15min，4℃離心;取一部分上清進行蛋白定量，另一部分處理后進行跑膠80v30min之后轉(zhuǎn)為120v100min;總蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離后， 轉(zhuǎn)移至PVDF膜上， 室溫下用5%脫脂牛奶封閉lh;加入一抗4 ℃過夜， 洗膜3次后， 加入二抗后室溫孵育1 h， 再洗膜3次， 經(jīng)化學發(fā)光系統(tǒng)（Alpha， USA）檢測蛋白表達水平。β-actin為內(nèi)參蛋白。

（3） MTT檢測法檢測對照組和轉(zhuǎn)染SiRNA組細胞活。收集對數(shù)生長期的MCF-7及轉(zhuǎn)染后的MCF-7細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，在37 ℃、5 % CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。待細胞貼壁后，10 μl的5 mg/ml的MTT加入每個孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，然后加入100 μl的DMSO，慢慢搖晃，使結(jié)晶逐漸溶解。最后用酶標儀測定在570 nm波長處的吸光度值（OD值），接下來計算細胞存活率，存活率=（實驗孔OD值/對照孔OD值）×100%

（三）流式細胞儀檢測凋亡和細胞周期

（1）收集細胞先向種好的六孔板中每孔加入500ul0.25%的胰酶，再分別加入1ml培養(yǎng)基，終止消化。吹打收集入離心管。

（2）細胞的固定收集之后轉(zhuǎn)速1500r/min離心5min棄上清，用預冷的PBS洗一遍，再加入300～500 ul預冷的PBS將細胞重懸。將細胞懸液緩慢逐滴加到10 ml預冷的75%乙醇（用PBS配置）中，用手輕彈。保存到-20度，一周內(nèi)檢測。

（3）細胞周期的檢測固定好之后，進行周期的檢測。取出固定好的細胞，放入離心機中，轉(zhuǎn)速1500r/min，10 min，再用預冷的PBS洗兩次，每管加入300～500的DNA染色液（現(xiàn)用現(xiàn)配），需避光放置于37度條件下染色20分鐘。最后用FACS Calibui BD流式細胞儀檢測細胞周期。

（4）統(tǒng)計學處理所有得到的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0應(yīng)用軟件，進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)均以x?± S表示，組間差異顯著性采用t來檢驗，p﹤0.05表示組間的差異具有顯著性，p﹤0.01表示組間的差異非常顯著。

三、實驗結(jié)果

（1）兩株乳腺癌細胞MCF-7轉(zhuǎn)染CSE siRNA，作用48h。轉(zhuǎn)染后的實驗組和對照組相比，顯影結(jié)果顯示出轉(zhuǎn)染后CSE的表達量明顯減少，表明轉(zhuǎn)染后下調(diào)了CSE表達量。

（2）MTT實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siRNA的實驗組細胞存活率比對照組存活率顯著降低（p<0.01）CSE下調(diào)抑制了細胞的生長活力。

（3）CSE下調(diào)阻滯了細胞周期并抑制了乳腺癌細胞的增殖流式細胞儀檢測出的結(jié)果表明經(jīng)過轉(zhuǎn)染實驗組相比于對照組，細胞周期明顯阻滯于s期，s期為細胞DNA復制合成期。下調(diào)CSE的表達量，能夠很明顯的使細胞周期阻滯在s期，即阻滯了DNA的合成，因此可以得出CSE的下調(diào)抑制了MCF-7細胞的增殖。

四、結(jié)論

MCF-7細胞轉(zhuǎn)染SiRNA后，CSE表達量降低。CSE的下調(diào)抑制了乳腺癌細胞的生長。CSE的下調(diào)使細胞周期阻滯在s期，抑制了細胞的增殖。

參考文獻：

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