楊金宏，陳正余，梁嘉俊，孔衛(wèi)青

（安康學院／陜西省蠶桑重點實驗室，陜西 安康 725000）

桑葉是?？粕俣嗄晟颈局参锷洌∕orus alba L.）的葉片，桑葉是養(yǎng)蠶業(yè)的基礎，同時還具有重要的食、藥用價值，位列我國衛(wèi)生部公布的藥食同源產品名單，并被收錄于《中華人民共和國藥典》（2010版）。桑葉的藥用價值早在《神農本草經》就有記載，其具有祛風清熱、涼血明目的功效，主治風熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花。夏桑菊、桑菊感冒丸等目前常見的中成藥配方均有桑葉成分。桑葉富含生物堿1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，1-DNJ）、黃酮類化合物以及多糖等生物活性成分［1］。其中1-DNJ具有降血糖、降血脂、抗炎、抗衰老、維持消化和排泄系統(tǒng)健康、抑制腫瘤等生物活性［2，3］，民間素有利用桑樹嫩葉降血糖的傳統(tǒng)［4］。桑葉黃酮具有很強的抗氧化能力，具有降血壓、降血糖、清除自由基、抑制血清脂質增加和抗粥樣硬化等藥理作用［5］。

同時桑樹還具有一定富硒能力，自然狀態(tài)下，桑樹的聚硒能力高于普通農作物［6］。通過人工添加外源硒的研究發(fā)現(xiàn)，桑樹的聚硒能力受外源硒含量影響顯著［7，8］。安康是我國最大的生態(tài)富硒區(qū)，被譽為中國硒谷，土壤平均硒含量高達0.4671 mg／kg［9，10］。安康地區(qū)桑葉茶硒含量最高可達1.771 5 mg／kg［11］，中藥材中，桑樹的硒含量僅次于豆腐柴［12］。

桑葉茶是利用桑樹嫩葉，參考茶葉工藝加工而成，以沖泡為主要食用方式的茶葉制品。目前對于桑葉茶的制作及其功能物質含量等的研究較多，但對于不同沖泡條件下各種功能性成分的溶出規(guī)律缺乏相應的研究。活性功能化合物的溶出率決定其生物利用度，因此本研究對安康地區(qū)桑葉茶中的1-DNJ、黃酮和硒含量以及不同沖泡溫度和時間對各成分溶出的影響進行研究，以期為桑葉茶的科學沖泡和桑葉的藥源利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

桑葉茶來自陜西福臻茶業(yè)有限公司，葉片源為陜西安康市平利縣的湖桑32，2019年春季生產，桑葉茶干粉為桑葉茶粉碎過80目篩。1-DNJ分析標準品（HPLC≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司，硒標準儲備液（1 000μg／mL）購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心，芴甲氧羰酰氯（99%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙腈、硝酸為優(yōu)級純，購自天津化學試劑廠。乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等為分析純。

1.2 桑葉茶黃酮含量的測定

1.2.1 標準曲線的制作 使用0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg／mL蘆丁標準液，按分光光度法［13］測定510 nm處吸光值，以標準蘆丁濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標，制作標準曲線。

1.2.2 試樣制備與含量測定 稱取桑葉茶粉0.5 g，加入60%乙醇50 mL進行提取，60℃提取2 h，10 000×g、25℃離心10 min，取上清液進行黃酮含量測定。根據510 nm處吸光度和標準曲線，計算樣品黃酮含量。

1.2.3 沖泡溫度對桑葉茶黃酮溶出的影響 稱桑葉茶粉0.5 g，分別加入70、80、90、100℃的水25 mL，水浴鍋保溫浸泡5 min，10 000×g、25℃離心10 min，取上清測定510 nm處吸光度，研究不同沖泡溫度桑葉茶黃酮的溶出量。

1.2.4 沖泡時間對桑葉茶黃酮溶出的影響 稱桑葉茶粉0.5 g，加入90℃水25 mL，室溫放置，分別沖泡2、4、6、8、10、12 min，10 000×g、25℃離心10 min，取上清測定510 nm處吸光度，研究不同沖泡時間桑葉茶黃酮的溶出量。

1.3 桑葉茶1-DNJ含量的測定

1.3.1 1-DNJ標準品的配制及其衍生化處理 精確稱取1-DNJ標準品2 mg，用50%乙腈溶液配制成0.2、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg／mL的標準溶液。取100μL樣本液，加入0.4 mol／L硼酸鉀緩沖液0.1 mL，5 mmol／L芴甲氧羰酰氯（FMOCCl）0.3 mL，25℃反應30 min后，加入50%乙腈溶液0.5 mL定容至1 mL。

1.3.2 色譜條件與標準曲線的確定 Kromasil C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇（A）+1%磷酸溶液（B）。進樣量10 μL，流速0.8 mL／min，柱溫35℃，走樣時間為50 min，紫外波長265 nm，設置完成后用流動相過柱子，按照以下梯度運行，0～20 min，A為50% ～70%；20～30 min，A為70%；30～35 min，A為70%～50%；35～50 min，A為50%。待基線穩(wěn)定后，將1-DNJ標準品溶液逐個進樣，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，以對應的1-DNJ濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并計算得到回歸方程。

1.3.3 桑葉茶1-DNJ含量的測定 稱取0.1 g桑葉茶干粉，加入50%乙腈溶液1.5 mL，研磨，過夜浸提，離心取上清液。不同溫度和時間試驗處理條件同黃酮溶出試驗。樣品的衍生方法、色譜測定條件同標準品。

1.4 桑葉茶總硒含量的測定

1.4.1 標準溶液的配制 移取硒標準儲備液用硝酸溶液按體積關系分別稀釋配制濃度為0、5、10、20、30μg／L的硒標準系列溶液。

1.4.2 試樣制備與含量測定 稱桑葉茶干粉0.5 g于聚四氟乙烯消解罐內，加硝酸5 mL浸泡過夜。蓋好內蓋，旋緊不銹鋼外套，放入恒溫干燥箱，160℃保持4 h，在箱內自然冷卻至室溫后，開蓋加熱干燥，將消解液吸入25mL容量瓶，用少量硝酸溶液（1%）洗滌接觸面3次，洗液合并至容量瓶中并用1%硝酸定容備用，同時做空白對照，ICP-MS法測定硒含量［14］。不同溫度和時間處理條件同黃酮溶出試驗。

2 結果與分析

2.1 桑葉茶干粉的黃酮、1-DNJ和硒含量

2.1.1 標準曲線 分別用蘆丁、1-DNJ和標準硒溶液制作了標準曲線（圖1），得蘆丁標準曲線的回歸方程為y＝2.510x+0.007，R2＝0.9996，表明吸光度值與濃度之間存在較好的線性關系，決定系數(shù)R2大于0.99，說明試驗的準確性高，分析結果穩(wěn)定。1-DNJ標準曲線的回歸方程為y＝77.4020x+1.6897，R2＝0.9997，說明1-DNJ質量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關系。硒標準曲線濃度回歸方程y＝147.260x+41.603，R2＝0.9998，表明硒濃度在0～30μg／L與熒光度呈良好的線性關系，硒的檢出最低限為0.13μg／L。

圖1 蘆丁、1-DNJ和硒標準曲線

2.1.2 桑葉茶黃酮、1-DNJ、硒含量 本研究設置2個樣品重復，根據計算公式，獲得桑葉茶中黃酮的含量為8.9120 mg／g，1-DNJ的含量為3.5516 mg／g，硒含量為0.2166 mg／kg（表1）。

表1 桑葉茶總黃酮、1-DNJ和硒含量

2.2 沖泡溫度對桑葉茶各成分溶出的影響

桑葉茶中黃酮、1-DNJ和硒三種功能成分的溶出量都隨沖泡水溫度的升高而增加，100℃時溶出最多（圖2）。這與茶葉沖泡水溫高一次浸出率高，沖泡水溫低一次浸出率低的結果一致。硒、1-DNJ和黃酮的溶出與溫度呈正相關，相關系數(shù)（Pearson’s R）分別為0.9925、0.9483和0.9943。其中1-DNJ在90℃增加最為明顯，較80℃增長1倍多。水溫過高時，葉綠素和多酚容易被氧化，桑葉中的單寧、凝集素、鞣酸等容易浸出，苦澀味道加重，因此認為90℃是比較適合于桑葉茶的沖泡溫度。

圖2 沖泡溫度對桑葉茶總黃酮、1-DNJ和硒溶出的影響

2.3 沖泡時間對桑葉茶各成分溶出的影響

沖泡時間短，茶湯顏色相對好，明亮度高；沖泡時間長，茶湯濃，澀味物質溶出較多，影響口感。所以在沖泡溫度90℃時，進一步研究沖泡時間對桑葉茶各成分溶出的影響。結果表明黃酮隨沖泡時間延長而增多，最優(yōu)擬合曲線為直線，y＝0.4401x+2.3740，R2＝0.9969，沖泡12 min，黃酮溶出7.53 mg／g，溶出率為84.49%（圖3）。

1-DNJ和硒元素溶出也隨沖泡時間延長而增多，但這兩種功能物質的溶出曲線為對數(shù)函數(shù)（圖4）。1-DNJ的溶出曲線為y＝141.89ln（x）+73.82，R2＝0.9915，沖泡12 min的溶出率為9.36%，用正常的泡茶方法不能得到很好的利用。硒的溶出曲線為y＝15.50ln（x）+44.74，R2＝0.9665，沖泡12 min，溶出0.071μg／g，溶出率為32.85%，可以通過正常沖泡桑葉茶獲得一定的補硒效果。

圖3 沖泡時間對桑葉茶黃酮溶出的影響

圖4 沖泡時間對桑葉茶1-DNJ和硒溶出的影響

3 討論與結論

我國桑樹資源豐富，種類繁多，分布廣泛，桑葉中功能成分含量受到諸多因素的影響，如桑葉中的黃酮和產地有關［15，16］，在國家種質（鎮(zhèn)江）桑樹圃，不同品種桑葉總黃酮含量在35.67～63.92 mg／g之間，野生桑樹含量較高［17］。河北省內不同品種及生長時期桑葉中總黃酮含量也存在差異，在22.47～32.65 mg／g之間［16］。本研究對產自陜西省安康市平利縣的桑葉茶黃酮含量進行測定，桑葉茶的黃酮含量為8.9120 mg／g，12 min的溶出率為84.49%，隨時間呈線性增長趨勢。這與明日葉茶的總黃酮溶出量在15 min內隨沖泡時間延長，迅速增加的研究結果一致［18］。

植物葉片的硒元素含量受多種因素影響，如植物種類、氣候、土壤硒含量等。安康地處富硒帶，本研究測得桑葉中硒元素含量為0.2166 mg／kg，而且以有機硒為主（無機硒未檢測到），符合富硒茶標準（GH／T 1090—2014）中硒含量要求（0.2～4.0 mg／kg）。本研究桑葉茶中硒的溶出規(guī)律符合對數(shù)方程，這與鳳凰單叢古茶樹葉片中硒的溶出規(guī)律一致［19］。本研究桑葉茶沖泡12 min硒溶出率為32.85%，溶出量為0.071μg／g，雖然高于鳳凰單叢古茶樹葉片硒的最大溶出量0.015μg／g，但泡茶方法不能充分利用桑葉茶中硒元素，需進一步改善加工利用工藝，提高硒的利用率。

桑葉中1-DNJ含量是衡量桑葉藥用價值的重要指標，其含量受桑樹品種、桑葉成熟度和采摘季節(jié)等影響［20-22］。1-DNJ的水溶出率較低，葉晶晶等利用正交試驗，優(yōu)化80℃以內水溫、pH、料液比等獲得1-DNJ的最高得率僅為0.062%［23］。由于桑葉茶主要食用其茶湯，溶出率是決定其有效成分生物利用的先決條件。本研究測得桑葉茶1-DNJ含量為3.5516 mg／g，沖泡水溫由80℃提高至90℃，1-DNJ的溶出有顯著提高，溶出率增加了1倍，但也僅為9.36%，說明用正常的泡茶方法不能很好地利用1-DNJ。