董元火，曾長立，許國權(quán)，廖新安，張洪干，張文才，夏恒建，王圣軍，彭仕梅，郭雙喜

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／湖北省漢江流域特色生物資源保護開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056；2.湖北省蘄春縣科學(xué)技術(shù)和經(jīng)濟信息局，湖北 蘄春 435399；3.李時珍醫(yī)藥集團有限公司，湖北 蘄春 435399；4.蘄春縣中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，湖北 蘄春 435399）

種質(zhì)資源作為生物資源的重要組成部分，是培育作物和中藥材優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是維系國家食物和藥品安全的重要保證［1］。藥用種質(zhì)資源是中藥材生產(chǎn)的源頭，種質(zhì)的優(yōu)劣對中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量有決定性作用［1］。因此，如何從藥材生產(chǎn)的源頭抓起，通過藥用植物種質(zhì)資源研究提高中藥材質(zhì)量是一個迫切需要解決的問題。

艾（Artemisia argyi Levl.et Vant.），又名艾蒿、灸草，為菊科篙屬多年生草本植物，廣布于中國、蒙古、日本和朝鮮等國家，以湖北蘄春產(chǎn)為佳，謂之“蘄艾”［2］。蘄艾是國家地理標志保護產(chǎn)品，“蘄春四寶”之一［3］。艾（蘄艾）是《湖北省農(nóng)業(yè)發(fā)展“十三五”規(guī)劃綱要》打造的兩個省級核心大品牌之一。黃岡市政府《關(guān)于加快發(fā)展蘄艾產(chǎn)業(yè)的意見（2018）》明確提出黃岡市要打造100億蘄艾產(chǎn)業(yè)目標。艾葉具有特殊香氣，味苦，性涼，具有顯著的平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗菌、抗過敏等作用［4］。艾葉含有揮發(fā)油、黃酮、有機酸和三萜類等多種化學(xué)成分［4］。桉油精、樟腦、龍腦、松油醇、石竹烯、側(cè)柏酮等為各產(chǎn)地艾葉揮發(fā)油的主要共有成分［5］。艾葉揮發(fā)油作為艾葉主要活性成分，已從中鑒定出近100個化學(xué)成分［6］。許俊潔等［7］從6個不同采收期蘄艾葉精油中初步鑒定了75種化合物，而桉油精是蘄艾揮發(fā)油含量較高的成分［7，8］。

艾（蘄艾）的前期研究主要涉及形態(tài)學(xué)、化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用、種植和生態(tài)學(xué)等方面［3-11］。近 年 來，一 些 學(xué) 者 利 用ITS2、rcbL、matK、psbA-trnH等DNA條形碼序列和葉綠體基因組高通量測序技術(shù)開展了艾草與菊科植物近緣種鑒定及系統(tǒng)關(guān)系和藥材的真?zhèn)畏治觯?2，13］。張英等［14］運用DNA身份精準鑒定技術(shù)多核苷酸多態(tài)性（MNP）標記法開展對蘄艾的精準鑒定，為準確甄別蘄艾的真?zhèn)翁峁┝诵碌姆椒?。目前，關(guān)于蘄艾的研究多為栽培種，野生蘄艾的研究鮮有報道［9］。

本研究對分布于蘄春的野生蘄艾藥用有效成分桉油精和蘆丁含量進行了測定，以期為野生蘄艾種質(zhì)資源保護和利用、新品種選育和藥材質(zhì)量評價提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

對分布于湖北省蘄春縣的野生蘄艾種質(zhì)資源開展野外調(diào)查，采用全球定位系統(tǒng)測定野生蘄艾種群所處經(jīng)緯度和海拔。記錄蘄艾種群棲息地的生境、分布特征和土壤類型。

在端午節(jié)前后，采集野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)的不同產(chǎn)地蘄艾的葉片，曬干，除去雜質(zhì)，用于桉油精和蘆丁含量測定。

1.2 主要儀器與試劑

Agilent7890A氣相色譜儀，賽默飛U3000高效液相色譜儀，梅特勒AG285萬分之一電子天平，梅特勒AB265-S十萬分之一電子天平，金壇市科興儀器廠數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4。

正己烷（分析純），甲醇（流動相中用色譜純，供試品制備用分析純），桉油精對照品（批號：110788-201506；來源：中國食品藥品檢定研究院），蘆丁對照品（批號：100080-201409；來源：中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 艾葉鑒別

取本品粉末2 g，加石油醚（60～90℃）25 mL，置水浴上加熱回流30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加正己烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取艾葉對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗［15］，吸取上述兩種溶液各2～5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）為展開劑展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的主斑點［15］。

1.4 艾葉桉油精含量測定

按照《中國藥典》2015版（通則0521）氣相色譜法（GC），在李時珍醫(yī)藥集團有限公司（湖北蘄春）測定艾葉桉油精含量［15］。

1.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以甲基硅橡膠（SE-30）為固定相，涂布濃度為10%；柱溫為110℃。理論板數(shù)按桉油精峰計算應(yīng)不低于1 000。

1.4.2 對照品溶液的制備 取桉油精對照品適量，精密稱定，加正己烷制成0.15 mg／mL的溶液，即得對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備 取本品艾葉粉末（過三號篩）約2.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入正己烷25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定重量，而后用正己烷補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.4.4 測定 精密吸取對照品與供試品溶液各2μL，注入氣相色譜儀，按通則0521氣相色譜法測定艾葉桉油精含量［15］。本品按干燥品計算，含桉油精不得少于0.050%［15］。

1.5 艾葉蘆丁含量的測定

按照《中國藥典》2015版（通則0512）高效液相色譜法（HPLC），以測定桑葉蘆丁含量的方法為參照［15］，在李時珍醫(yī)藥集團有限公司（湖北蘄春）對艾葉蘆丁含量進行測定。

1.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動相A，以0.5%磷酸溶液為流動相B，按表1進行梯度洗脫，檢測波長為358 nm。理論板數(shù)按蘆丁峰計算應(yīng)不低于5 000。

1.5.2 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蘆丁0.1 mg的溶液，即得對照品溶液。

1.5.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾渣再用甲醇50 mL同法提取2次，合并濾液。減壓回收溶劑，殘渣用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

表1 流動相A和流動相B的梯度洗脫

1.5.4 測定 精密吸取對照品與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按通則0512高效液相色譜法測定艾葉蘆丁含量［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地野生蘄艾的生境及分布特征

本次調(diào)查在湖北省蘄春縣的赤龍湖、翁塹村、九棵松村和清水河村發(fā)現(xiàn)了4個野生蘄艾種群，多散生或塊狀分布于居民屋前后及田堤邊、山邊和溝渠邊（表2）。

表2 蘄春縣不同產(chǎn)地野生蘄艾的生境及分布特征

2.2 不同產(chǎn)地野生蘄艾的桉油精含量

按艾葉干燥品計算，蘄春縣赤龍湖、九棵松村、翁塹村和清水河村4個產(chǎn)地的野生蘄艾桉油精含量在0.45%～0.73%之間（表3），存在差異性，平均值為0.59%。其中，赤龍湖蘄艾桉油精含量最高，翁塹村蘄艾桉油精含量最低。

2.3 不同產(chǎn)地野生蘄艾的蘆丁含量

按艾葉干燥品計算，蘄春縣4個產(chǎn)地的野生蘄艾蘆丁含量在0～0.0182%之間（表3），平均值為0.0103%，表明野生蘄艾蘆丁含量比較低。其中，清水河村的野生蘄艾蘆丁含量最高，翁塹村野生蘄艾中未檢出蘆丁。

表3 蘄春縣不同產(chǎn)地野生蘄艾的桉油精和蘆丁的含量 （%）

3 討論與結(jié)論

中國民間有端午采艾的習(xí)俗，2010年和2015年《中國藥典》中規(guī)定艾葉在夏季時采摘［15，16］。艾葉主要活性成分是艾葉揮發(fā)油［8］。許俊潔等［7］通過提取不同采收期蘄艾精油，發(fā)現(xiàn)6月蘄艾精油含量最高，表明6月為蘄艾的最佳采收期，符合2010年《中國藥典》的規(guī)定并論證了民間端午采艾的科學(xué)性［7］。因此，本研究選擇6月9日（端午節(jié)）至6月10日采摘野生蘄艾。

作為艾葉主要活性成分的艾葉揮發(fā)油，一直被視為評價其藥材質(zhì)量的標準。各地艾葉中含量明顯較高且普遍含有的成分有桉油精、樟腦、龍腦、松油醇（包括α-松油醇和順式-β-松油醇）、側(cè)柏酮、氧化石竹烯等［5］。研究表明蘄艾揮發(fā)油含量較高的成分是桉油精［7，8］，桉油精含量是艾葉質(zhì)量控制的重要指標之一［17］。因此，為了更好地評價野生蘄艾的種質(zhì)資源和品質(zhì)，本研究對發(fā)現(xiàn)的野生蘄艾開展了桉油精（C10H8O）含量的測定。2015年版《中國藥典》中規(guī)定，艾葉按干燥品計算，含桉油精不得少于0.050%［15］。本研究采用《中國藥典》2015版（通則0512）氣相色譜法（GC）測定了蘄春縣赤龍湖、九棵松村、翁塹村和清水河村4個產(chǎn)地野生蘄艾的桉油精含量，結(jié)果顯 示 在0.45% ～0.73% 之 間，平 均 值 為0.59%，高于《中國藥典》2015版規(guī)定的桉油精含量［15］；其中蘄春縣赤龍湖蘄艾桉油精含量最高，其藥材品質(zhì)最好。戴衛(wèi)波等［5］采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析3個產(chǎn)地栽培蘄艾的桉油精含量分別為16.97%、20.53% 和21.3912%。同樣采用GC-MS的方法，許俊潔等［7］報道源自湖北蘄春一世緣蘄艾制品有限公司提供的栽培蘄艾在6月份的桉油精含量為24.62%。林杰等［18］測定栽培蘄艾的桉油精含量高達25%。本研究測定的4個地方野生蘄艾桉油精含量都低于上述栽培蘄艾中的含量，其原因可能是GC-MS法較GC法測定的桉油精含量高，這有待于進一步對同一地點的野生蘄艾開展兩種測定方法對比分析，因此還不能斷定野生蘄艾的品質(zhì)不如栽培蘄艾。

植物界中黃酮類化合物存在廣泛，黃酮類也是艾葉的主要化學(xué)成分之一［5，19］。目前，多以蘆丁或槲皮素作為艾葉中總黃酮含量測定的對照品［19，20］。本研究按照《中國藥典》2015版（通則0512）高效液相色譜法（HPLC），以測定桑葉蘆丁含量的方法為參照［15］，對蘄春縣赤龍湖、九棵松村、翁塹村和清水河村等4個產(chǎn)地的野生蘄艾蘆丁含量進行了測定，結(jié)果顯示野生蘄艾蘆丁含量在0～0.0182%之間，平均值為0.0103%，表明野生蘄艾蘆丁含量比較低。胡吉清等［19］發(fā)現(xiàn)芹菜素對照品溶液與供試品溶液有相同的最大吸收波長，首次用芹菜素作為對照品測得艾葉總黃酮含量。蘆丁、槲皮素和芹菜素都可作為對照標樣用于測定艾葉總黃酮含量。