張楠楠，汪海斌，呂光達

(1 亳州市產品質量監(jiān)督檢驗所，安徽 亳州 236800；2 國家中藥材產品質量監(jiān)督檢驗中心，安徽 亳州 236800；3 亳州含量無憂中藥材檢測有限公司，安徽 亳州 236800)

中藥大黃為寥科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim, ex Balf. 或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的干燥根和根莖[1]。性寒，味苦，歸脾、胃、大腸、肝、心包經，是我國傳統(tǒng)的四大中藥之一。具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經，利濕退黃之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，大黃有調節(jié)胃腸功能、抗病原微生物、抗炎、保護心腦血管、抗腫瘤、保肝利膽等作用[2-5]。

大黃藥材所含化學成分眾多，主要有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、苯丁酮類、鞣質類、多糖類等成分，其中，蒽醌類成分是其主要活性物質[6-8]。眾所周知，中藥的質量差異與其來源及產地有著很深的聯(lián)系。已報道的關于大黃藥材的相關文獻中[9-10]，掌葉大黃和唐古特大黃質量較好，藥用大黃質量較差。而產地不同，大黃的質量差異也較大。本實驗采用HPLC法，對15批不同產地的掌葉大黃中游離蒽醌與總蒽醌的含量進行測定，并對測定結果進行聚類分析和主成分分析，以期為大黃的質量評價及深入研究提供參考。

1 實 驗

1.1 材 料

1.1.1 試 材

掌葉大黃藥材共15批樣品由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供，均經安徽中醫(yī)藥大學周建理教授鑒定為掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根和根莖。詳細信息見表1。對照品蘆薈大黃素(批號110795-201609)；大黃酸(批號110757-201607)；大黃素(批號110756-201512)；大黃酚(批號110796-201520)；大黃素甲醚(批號110758-201415)來自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

表1 掌葉大黃詳細信息一覽表Table 1 List of detailed information of Rheum palmatum

1.1.2 儀 器

高效液相色譜儀，美國Waters e2695；Waters XBridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；KQ-205 型數控超聲清洗器，昆山超聲儀器有限公司；XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；R-215旋轉蒸發(fā)儀，瑞士布奇有限公司；AX224ZH萬分之一天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；XPE56C百萬分之一天平，美國賽多利斯有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，線性梯度洗脫(0～5 min，70%A；5～6 min，70%→85% A；6～17 min，85% A；17～18 min，85%→70% A；18～22 min，70% A)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL。

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 混合對照品溶液

精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚適量，加甲醇分別制成每1 mL含蘆薈大黃素87.4 μg、大黃酸83.3 μg、大黃素80.7 μg、大黃酚81.8 μg、大黃素甲醚43.4 μg的對照品母液；分別精密量取上述對照品母液各2 mL，混勻，即得每1 mL中含蘆薈大黃素17.5 μg、大黃酸16.7 μg、大黃素16.1 μg、大黃酚16.4 μg、大黃素甲醚8.7 μg的混合對照品儲備液。

1.2.2.2 游離蒽醌供試品溶液

取本品粉末(過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.2.3 總蒽醌供試品溶液

取本品粉末(過四號篩)約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2 結果與討論

2.1 線性關系考察

精密吸取0.5、2、8、12、16 μL上述對照品母液，注入液相色譜儀，以對照品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的線性回歸方程：Y=4791X-35356，R2=0.9999；Y=3376.4X-37273，R2=0.9999；Y=3660.2X-22264，R2=0.9999；Y=5079.3X-33574，R2=0.9999；Y=869.41X-6965，R2=0.9998；結果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進樣量分別在43.7～1398.4、41.65～1332.8、40.35～1291.2、40.9～1308.8、21.7～694.4 ng 區(qū)間線性關系良好。

2.2 精密度實驗

取上述混合對照品溶液，按“1.2.1”色譜條件連續(xù)測定。計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.46%、0.55%、0.77%、0.61%、0.98% (n=6)，說明儀器精密性良好。

2.3 穩(wěn)定性實驗

取11號樣品，按“1.2.2.2”和“1.2.2.3”項下方法各制備1份供試品溶液，于制備后4、8、12、16、24 h按“1.2.1”色譜條件測定，計算游離蒽醌中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.43%、0.55%、0.51%、0.62%、0.87%，總蒽醌中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚面積的RSD 分別為0.76%、0.64%、0.80%、0.75%、0.93%，結果說明24 h內供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4 重復性實驗

取11號樣品，按“1.2.2.2”和“1.2.2.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“1.2.1”色譜條件測定。計算游離蒽醌中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量平均值的RSD分別為0.52%、0.67%、0.63%、0.89%、1.17%；總蒽醌中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量平均值的RSD分別為0.66%、0.71%、0.69%、0.97%、1.33%，表明本方法的重復性良好。

2.5 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量的11號掌葉大黃樣品0.2 g共6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液適量，按“1.2.2.2”項下方法制備供試溶液，按“1.2.1”色譜條件進樣測定，計算游離蒽醌的回收率。

精密稱取已知含量的11號掌葉大黃樣品0.1 g 共6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液適量，按“1.2.2.3”項下方法制備供試溶液，按“1.2.1”色譜條件進樣測定，計算總蒽醌的回收率。

回收率計算結果顯示，游離蒽醌和總蒽醌的加樣回收率為96.8%～102.1%，RSD值為0.83%～1.4%，表明本方法的準確度良好。

2.6 樣品含量測定

取15批不同產地的掌葉大黃進行色譜分析，色譜圖見圖1。計算掌葉大黃中游離蒽醌和總蒽醌含量后，再計算結合蒽醌含量(總蒽醌含量-游離蒽醌含量)，結果見表2。

圖1 混合對照品及11號掌葉大黃樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances and Rheum palmatum sample No.11

結合表2可以看出，不同產地的掌葉大黃蒽醌類成分含量差異較大，甘肅宕昌掌葉大黃中游離蒽醌含量較高，結合蒽醌含量較低；青海玉樹與甘肅隴西掌葉大黃結合蒽醌含量較高，可能受到地理、氣候等因素的影響，不同產地掌葉大黃蒽醌類成分的富集程度也有所不同。

表2 樣品含量測定結果(n=2)Table 2 Determination results (n=2) (mg·g-1)

2.7 聚類分析

本實驗根據測得樣品的游離蒽醌、總蒽醌和結合蒽醌類成分的含量，將含量數據導入SPSS 19.0 軟件進行聚類分析，結果見圖2。聚類閾值為5時，15批樣品分為4小類，即甘肅宕昌，陜西城固，青海玉樹，甘肅禮縣、甘肅隴西。閾值為10時，15批樣品分為3類，即甘肅宕昌為一類，青海玉樹為一類，陜西城固、甘肅禮縣、甘肅隴西為一類。閾值為15時，掌葉大黃樣品可以分為兩大類，即甘肅宕昌掌葉大黃為一類，其它產地掌葉大黃為一類。結果表明，除了甘肅禮縣和甘肅隴西兩個產地掌葉大黃有交叉外，產地相同的掌葉大黃樣品聚為一類，其蒽醌類成分含量相似。不同產地掌葉大黃的蒽醌類成分含量與其產地生長環(huán)境存在著一定的聯(lián)系，甘肅禮縣和甘肅隴西掌葉大黃樣品，因海拔、產地相近，兩類差異較??；陜西城固海拔與甘肅隴西、禮縣比較相近，三者產地大黃差異較??；甘肅宕昌、青海玉樹掌葉大黃可能因海拔與其它三地相差較大，各自聚為一類。

圖2 15批掌葉大黃聚類分析圖Fig.2 Hierarchical clustering analysis of 15 batches of Rheum palmatum

2.8 主成分分析(PCA)

將含量數據導入SIMCA 13.0 軟件，以掌葉大黃中的游離蒽醌、總蒽醌和結合蒽醌類成分含量為X 變量，15個批次的掌葉大黃為Y 變量，將數據標準化后進行PCA，見圖3。甘肅禮縣與甘肅隴西兩個產地掌葉大黃在分布上有區(qū)域交叉，陜西城固掌葉大黃又與甘肅禮縣、隴西的較接近，甘肅宕昌、青海玉樹掌葉大黃與其它產地的較為疏遠，海拔高度越接近的居群，其主成分空間的分布位置也越接近，這也與上述聚類分析的結果相吻合。

圖3 15批掌葉大黃的PCA 圖Fig.3 The PCA score plot of 15 batches of Rheum palmatum

2.9 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

圖4 15批掌葉大黃的PLS-DA 得分圖Fig.4 The PLS-DA score plot of 15 batches of Rheum palmatum

圖5 15批掌葉大黃的PLS-DA 載荷圖Fig.5 The PLS-DA Load vector diagram of 15 batches of Rheum palmatum

圖6 蒽醌類成分的貢獻值(VIP 值)Fig.6 Variable importance of the anthraquinone components in the project value(VIP)

3 討 論

3.1 流動相比例的考察

本實驗分別比較了流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(85:15)、乙腈-0.1%磷酸溶液(80:20)等度洗脫以及乙腈-0.1%磷酸溶液(70:30)梯度洗脫比例，選用等度洗脫流動相比例時，大黃樣品游離蒽醌中的蘆薈大黃素峰易受到雜峰干擾，分離效果較差，而梯度洗脫比例則能將蘆薈大黃素峰很好的分離，綜合考慮到分析蒽醌類化合物的含量，選擇乙腈-0.1%磷酸溶液(70:30)梯度洗脫作為流動相。

3.2 氣溫、海拔對大黃蒽醌類成分的影響

特有的氣候因子條件有利于藥材活性成分的形成和積累，從而影響藥材品質。有研究表明，氣溫是影響掌葉大黃品質主要的氣候因子之一，對掌葉大黃化學成分含量的富集起到至關重要的作用[11]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)在大黃的5個不同產地中，青海玉樹與甘肅隴西兩地掌葉大黃總結合蒽醌含量較高，結合5個產地的年平均氣溫分析，青海玉樹與甘肅隴西的年平均氣溫較其它三個產地低，推測可能是掌葉大黃藥材在低氣溫的影響下，更有利于其富集結合蒽醌類化合物。

同時，也有相關研究發(fā)現(xiàn)，大黃化學成分與海拔高度之間顯著相關[12-14]。至于其形成原因，認為是不同海拔高度的土壤、光照、溫度和濕度等環(huán)境因素綜合作用的結果。本實驗的聚類分析和主成分分析結果也表明，同一海拔的掌葉大黃藥材中蒽醌類成分含量間存在相似性，海拔接近的甘肅禮縣、隴西兩個產地掌葉大黃在分布上有區(qū)域交叉，這可能從另一方面提示了海拔對掌葉大黃藥材品質的影響。

3.3 不同產地大黃蒽醌類組分含量的差異可能導致其不同功效活性差異

結合大黃相關藥理學研究文獻表明，大黃中游離蒽醌類成分與其“清熱解毒”功效相關[15]，結合蒽醌類成分則與其“瀉下攻積”功效相關[16-17]，因此，不同產地大黃在蒽醌類組分含量上的差異，很有可能會導致其在不同功效上產生差異。以此推斷，在本次實驗的5個產地掌葉大黃中，游離蒽醌類化合物含量最高的甘肅宕昌掌葉大黃，其清熱解毒功效最強；結合蒽醌類化合物含量較高的青海玉樹與甘肅隴西掌葉大黃，其瀉下作用可能較強。

4 結 論

本研究建立了HPLC法測定不同產地掌葉大黃藥材中蒽醌類成分含量的方法，同時對掌葉大黃的蒽醌類成分含量進行了多元統(tǒng)計分析，15批掌葉大黃的聚類分析及主成分分析說明不同產地的掌葉大黃的蒽醌類化學成分與其產地、海拔等環(huán)境存在著一定的相關性，偏最小二乘判別分析篩選出總大黃酸、結合蒽醌大黃酸、結合蒽醌大黃素的VIP值均>1.2，表明這幾個成分可能是15批掌葉大黃樣品蒽醌類成分的主要差異標志物，從而為大黃的質量評價提供了參考依據。