韋玉燕，何 科，吳勇梅，王小新，龐云娟

(1 玉林市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院，廣西 玉林 537000；2 玉林市食品藥品檢驗檢測中心，廣西 玉林 537000)

藥品在生產(chǎn)過程中很容易受到微生物的污染，對患者存在較大的安全隱患?！吨袊幍洹?015版規(guī)定口服制劑必須要進(jìn)行微生物檢驗。但不同的藥品對微生物存在不同程度的抑制或殺滅作用[1]，因此，《中國藥典》2015年版要求所有要進(jìn)行微生物限度檢查的藥品都要按照現(xiàn)版藥典要求重新進(jìn)行相關(guān)驗證[2]。本文查閱相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)《中國藥典》2015年版相關(guān)要求，對我院院內(nèi)制劑傷科解毒顆粒進(jìn)行微生物限度檢查方法學(xué)驗證，建立符合規(guī)定的微生物限度檢查方法，為該制劑的質(zhì)量控制提供了檢驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 菌 種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63501]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10 104]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001] 。

1.2 試驗樣品

傷科解毒顆粒(批號：20170718、20170802、20170809)，玉林市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院。

1.3 儀器與試劑

JJ1000型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；SHB-1生化培養(yǎng)箱，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠；MJ-180B霉菌培養(yǎng)箱，上海賀德實驗設(shè)備有限公司；DHG-9006型9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏；BHC-1300HA2生物安全柜，蘇州安春游空氣技術(shù)有限公司；YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌器，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：170329)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：170526)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；麥康凱液體培養(yǎng)基(批號：170313)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(170325)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號：160405)，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鈉(批號：20150108)，西隴科學(xué)股份有限公司。

2 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法驗證研究[3-6]

2.1 菌液的制備

按照《中國藥典》2015年版四部要求分別制備金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉等6種菌株的菌懸液，每種菌懸液含菌數(shù)均不大于10000 cfu/mL。

2.2 供試液的制備

取傷科解毒顆粒10 g，加無菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)至100 mL，搖勻，即得1:10的供試液。再取1:10供試液適量，用無菌TSB依次稀釋成1:20、1:50、1:100的供試液，備用。

2.3 回收率試驗

試驗組：取“2.2”項下各供試液10 mL置已滅菌的試管中，分別加入“2.1”項下菌懸液各0.1 mL，搖勻，分別取1 mL注入平皿中，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，放到適宜的溫度下培養(yǎng)，計數(shù)。

菌液組：取無菌TSB培養(yǎng)基10 mL數(shù)份置已滅菌的試管中，分別加入“2.1”項下菌懸液各0.1 mL，搖勻，分別取1 mL注入平皿中，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，放到適宜的溫度下培養(yǎng)，計數(shù)。

供試品對照組：分別取“2.2”項下供試品溶液1 mL注入平皿中，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基，放到適宜的溫度下培養(yǎng)，計數(shù)。

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在22.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在32.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。

比值R= (試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/菌液對照組菌落數(shù)

根據(jù)《中國藥典》2015版四部規(guī)定，若比值R在0.5～2范圍內(nèi)，則可認(rèn)為該測定方法適合該品種的菌落計數(shù)。

2.4 方法驗證[3-6]

2.4.1 預(yù)實驗

選用金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為敏感菌株來進(jìn)行預(yù)試驗，結(jié)果見表1和表2。

表1 金黃色葡萄球菌預(yù)試驗菌回收比值結(jié)果Table 1 Recovery ratio results of staphylococcus aureus pre-test bacteria

表2 白色念珠菌預(yù)試驗菌回收比值結(jié)果Table 2 Recovery ratio results of candida albicans pre-test bacteria

預(yù)試驗結(jié)果：1:10的供試液(1 mL/皿)組中金黃色葡萄球菌回收比值為0.71，在0.5～2范圍內(nèi)，表明傷科解毒顆粒對需氧菌沒有抑制作用，采用該方法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計數(shù)可行；1:10的供試液(1 mL/皿)組中白色念珠菌回收比值為0.75，在0.5～2范圍內(nèi)，表明傷科解毒顆粒對霉菌和酵母菌沒有抑制作用，采用該方法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)應(yīng)該可行。

根據(jù)初試驗結(jié)果，初步確定傷科解毒顆粒需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)方法為常規(guī)平皿法(1:10供試品溶液1 mL/皿)。

2.4.2 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的驗證

取3批傷科解毒顆粒樣品，需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)均按常規(guī)平皿法(1:10供試品溶液1 mL/皿)進(jìn)行5種菌加菌回收試驗，結(jié)果見表3。

表3 3批傷科解毒顆?；厥毡戎翟囼灲Y(jié)果Table 3 Test results of recovery ratio of 3 batches of Shangke Jiedu Granules

3批樣品的加菌回收驗證試驗結(jié)果表明，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)規(guī)定的五種試驗菌及沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)規(guī)定的兩種試驗菌的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，表明該方法可以用于傷科解毒顆粒的微生物限度檢查。

3 控制菌檢驗方法的建立與驗證

3.1 大腸埃希菌—增菌液常規(guī)法預(yù)實驗

陽性菌對照組：取100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，依次加入“2.2”項制備好的1:10供試液10 mL，“2.1”項中的大腸埃希菌菌懸液10 μL，混勻，即得陽性菌對照組。

陰性菌對照組：取100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，依次加入“2.2”項制備好的1:10供試液10 mL，“2.1”項中的金黃色葡萄球菌懸液10 μL，混勻，即得陰性菌對照組。

樣品組：取100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，加入“2.2”項制備好的1:10供試液10 mL，混勻，即得樣品組。

以上三組試液置于30～35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。取培養(yǎng)物1 mL接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，于42～44 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，30～35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～72 h，觀察各平板上的菌落形態(tài)。結(jié)果見表4。

表4 增菌液常規(guī)法檢查大腸埃希菌預(yù)試驗結(jié)果Table 4 Pre-test results of routine examination of Escherichia coli with enrichment solution

結(jié)果表明，采用增菌液常規(guī)法檢查傷科解毒顆粒中的大腸埃希菌，方法應(yīng)該可行。

3.2 大腸埃希菌檢查方法的驗證

取3個批號的傷科解毒顆粒，大腸埃希菌按照增菌液常規(guī)法進(jìn)行加菌驗證試驗，結(jié)果見表5。

表5 3批傷科解毒顆粒大腸埃希菌驗證試驗結(jié)果Table 5 Validation test results of Escherichia coli from 3 batches of Shangke Jiedu Granules

三批樣品的驗證試驗結(jié)果表明，采用增菌液常規(guī)法對傷科解毒顆粒的大腸埃希菌的測定進(jìn)行加菌驗證試驗，符合《中國藥典》2015年版四部1106(非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法)的有關(guān)規(guī)定，方法可行。

4 結(jié) 論

(1)蘇潤萍[7]關(guān)于驗證方法的選擇做出了優(yōu)勢優(yōu)先排序：常規(guī)法>稀釋法>中和法>薄膜過濾法>幾種方法聯(lián)合使用，因此本文優(yōu)先驗證常規(guī)法。本文采用常規(guī)法，驗證了1:10、1:20、1:50、1:100等稀釋級別的菌落回收情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1:10的供試液組對藥典規(guī)定的5 種驗證菌的回收率均在 50%～200% 范圍內(nèi)，故認(rèn)為常規(guī)平皿法(1:10供試品溶液1 mL/皿)可用于傷科解毒顆粒的微生物限度檢查。大腸埃希菌常規(guī)法驗證時發(fā)現(xiàn)陽性菌對照組菌落生長良好，陰性菌對照組沒有菌落生長，表明該品種對大腸埃希菌沒有抑制作用，檢查方法的專屬性好，可用于大腸埃希菌的檢查。

(2)傷科解毒顆粒含有金銀花、蒲公英、青天葵等中藥材，文獻(xiàn)報道這三種中藥材均有較強的抑菌活性，但必須要達(dá)到最小的抑菌濃度[8-10]。本實驗結(jié)果顯示，傷科解毒顆粒對藥典規(guī)定驗證用的5種試驗菌種的抑菌活性較小，考慮可能是一定量的顆粒溶解后未達(dá)到最小的抑菌濃度或者是顆粒在制備過程中經(jīng)過高溫破壞了抑菌活性成分所致。