李遠(yuǎn)洋，李玉姍，王芳芝，余耀琨，曾靖雯

(肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

單胺氧化酶(MAO)主要分布在脊椎動(dòng)物的大腦和肝臟中，單胺氧化酶有兩種亞型，分別為MAO-A和MAO-B，其中MAO-A是抗抑郁藥物研發(fā)的靶點(diǎn)之一。主要分布在兒茶酚胺能神經(jīng)元中，使單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失活。單胺氧化酶抑制劑通過(guò)抑制單胺氧化酶的對(duì)單胺類物質(zhì)的氧化活性，達(dá)到減輕或者消除由各種原因引起的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)減少或單胺氧化酶活性過(guò)高導(dǎo)致的疾病。

抑郁癥是現(xiàn)代患病率較高的精神疾病之一，成因復(fù)雜，藥物治療仍然是目前臨床最重要的治療方式，大多數(shù)抗抑郁藥都是基于增強(qiáng)體內(nèi)單胺能神經(jīng)傳遞濃度的基礎(chǔ)上研發(fā)的，如三環(huán)類抗抑郁藥物、單胺氧化酶抑制劑及選擇性五羥色胺再攝取抑制劑，前兩者藥物副作用較大，從天然藥物中尋找耐受性更好，更安全的藥物為治療抑郁癥提供了新的方向。

許多天然藥物揮發(fā)油被證實(shí)具有治療、緩解抑郁癥的效果[1-2]，例如迷迭香與檸檬草揮發(fā)油處理后的小鼠表現(xiàn)出行為性活躍有所恢復(fù)[3]，具有一定的抗抑郁作用。

本項(xiàng)工作中以MAO-A為靶點(diǎn)蛋白，應(yīng)用DS分子模擬軟件，運(yùn)用CDOCKER對(duì)接方法，在CHARMnm力場(chǎng)下進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白MAO-A與從天然藥物中選取的小分子配體的對(duì)接，研究天然藥物揮發(fā)油組分與靶點(diǎn)蛋白MAO-A的相互作用，為抗抑郁藥物苗頭化合物的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)修飾提供思路。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 配體小分子的準(zhǔn)備

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[3-4,6-12]，查得可能具有抗抑郁作用的揮發(fā)油主要成分12種：梨醇酯、芳樟醇、迷迭香酸、香葉木素、木犀草素、乙酸芳樟酯、薄荷酮、D-檸檬烯、松油醇、α-松油烯、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚，通過(guò)DS直接構(gòu)建天然藥物揮發(fā)油組分結(jié)構(gòu)，或者利用ChemOffice[13]畫圖拷貝到DS。考慮對(duì)映異構(gòu)體、pH等因素，通過(guò)DS產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)、加氫、產(chǎn)生異構(gòu)體等。經(jīng)過(guò)處理產(chǎn)生配體小分子，隨后依次利用DS中的Prepare Ligands，F(xiàn)ull Minimization功能，對(duì)配體小分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)及力場(chǎng)優(yōu)化處理，將處理后的小分子文件導(dǎo)出為PDB格式備用。

1.2 MAO-A受體蛋白的準(zhǔn)備

PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)是目前最主要的收集生物大分子(蛋白質(zhì)、核酸和糖)2.5維結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)。

本研究選取MAO-A受體蛋白來(lái)自于RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)(PDBID:2Z5X)，通過(guò)Discovery Studio軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載的受體蛋白PDB文件進(jìn)行去除水分子、原配體分子和蛋白分子加極性氫處理，最終得到所需MAO-A受體蛋白PDBQT文件。

1.3 對(duì)接環(huán)境準(zhǔn)備

使用DS提取靶點(diǎn)蛋白MAO-A構(gòu)象，去除多余氨基酸殘基，并保存為pdb文件，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[1-8]，以蛋白空腔拓展為活性中心，SBD_Site_Sphere球體參數(shù)設(shè)置與對(duì)接驗(yàn)證見(jiàn)表1，配體參數(shù)設(shè)置完成后均能與2z5x原配體肉葉蕓香堿成功對(duì)接，對(duì)接結(jié)果與文獻(xiàn)[15]同一數(shù)量級(jí)，驗(yàn)證參數(shù)設(shè)置有效。

表1 Discovery Studio模擬對(duì)接中蛋白活性位點(diǎn)設(shè)置參數(shù)Table 1 Parameters of protein active site setting in Discovery Studio docking

1.4 小分子與受體蛋白模擬對(duì)接

分子對(duì)接是通過(guò)把配體分子放在受體活性位點(diǎn)的位置，然后按照幾何互補(bǔ)、能量互補(bǔ)以及化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則來(lái)實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)配體與受體相互作用的強(qiáng)弱，并找到兩個(gè)分子之間最佳的結(jié)合模式。其中包括CDOCKER-精準(zhǔn)分子對(duì)接、全柔性受體-配體對(duì)接、DS LibDock-快速的分子對(duì)接以及分子對(duì)接后的構(gòu)象分析，本研究中選用CDOCKER-精準(zhǔn)對(duì)接模式[17]模擬MAO-A與天然藥物揮發(fā)油成分小分子對(duì)接。

1.4.1 受體結(jié)合位點(diǎn)的選擇

定義結(jié)合位點(diǎn)對(duì)分子對(duì)接結(jié)果有直接影響，定義結(jié)合位點(diǎn)主要有三種方法，一是配體擴(kuò)張法，即以原配體(共晶化合物)所在位置為活性中心擴(kuò)張一定的范圍，此范圍內(nèi)的氨基酸殘基則定義為活性位點(diǎn)；二是文獻(xiàn)檢索法，即通過(guò)文獻(xiàn)檢索找到已報(bào)道的活性位點(diǎn)來(lái)定義結(jié)合位點(diǎn)；三是軟件預(yù)測(cè)法，即通過(guò)DS軟件分析最有潛力的結(jié)合位點(diǎn)。

由于該蛋白有共晶化合物，因此本研究主要運(yùn)用文獻(xiàn)檢索法與活性中心擴(kuò)張法定義受體結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)置原配體所在位置為活性中心，通過(guò)調(diào)整SBD_Site_Sphere球體半徑及位置，令球體的空腔即為活性位點(diǎn)。原則上，要保證球體將配體全部包裹，但球體大小不宜過(guò)大，否則會(huì)使不同的小分子對(duì)接至受體的其他位置造成結(jié)果偏移，球體的大小會(huì)直接影響對(duì)接結(jié)果。

1.4.2 精準(zhǔn)分子對(duì)接技術(shù)(CDOCKER)

采用DS中的CDOCKER對(duì)接技術(shù)進(jìn)行揮發(fā)油成分小分子與MAO-A受體蛋白模擬對(duì)接，CDOCKER是在CHARMm立場(chǎng)下產(chǎn)生高精度分子對(duì)接結(jié)果的技術(shù)。通過(guò)對(duì)電子(量子論)與原子(立場(chǎng)法)的比較，選用適用于生物大分子的模擬，計(jì)算量相對(duì)小10倍的分子立場(chǎng)法。在適當(dāng)范圍內(nèi)，該法較量子論計(jì)算方法的精準(zhǔn)度相差無(wú)幾。DS中的CHARMm力場(chǎng)函數(shù)復(fù)雜度較低，精確度較高。函數(shù)關(guān)系如下：

Epot=Ebond+Eangle+Etorsion+Eoop→internal terms

+Eelec+EvdW→internal/external terms

+Econstraint+Euser→special

MAO A從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，快速直接將蛋白質(zhì)溶解在不同的pH值下，設(shè)置顯性溶劑環(huán)境，為避免原子受到較大的擾動(dòng)而造成體系計(jì)算失敗(特別是體系升溫過(guò)程)。進(jìn)行能量?jī)?yōu)化消除蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部蛋白質(zhì)與水分子之間的一些觸碰及結(jié)構(gòu)不合理區(qū)，同時(shí)采用PME法進(jìn)行靜電處理。采用緩慢升溫(1ps升溫10 K)，即升溫過(guò)程選擇true，避免直接將體系溫度升高到較高的體系模擬的溫度時(shí)，體系內(nèi)原子位移較大而計(jì)算失敗的現(xiàn)象。待體系經(jīng)過(guò)一定時(shí)間達(dá)平衡后進(jìn)行采樣。并從MD的采樣數(shù)據(jù)中預(yù)測(cè)二面角、RMSD、體系能量、勢(shì)能、氫鍵數(shù)量、配體受體氫鍵作用的變化。

首先對(duì)靶點(diǎn)蛋白，配體小分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)及力場(chǎng)優(yōu)化處理，其次設(shè)置好活性位點(diǎn)，球體的坐標(biāo)和半徑，Top Hits等參數(shù)后運(yùn)行，進(jìn)行精準(zhǔn)分子對(duì)接。

1.4.3 分子對(duì)接構(gòu)象結(jié)果分析

分子之間的非鍵相互作用是生命體系中分子識(shí)別的基礎(chǔ)，藥物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵之一就是分析分子間的相互作用情況。DS中的對(duì)接結(jié)果報(bào)告將對(duì)接過(guò)程中的各種相互作用力總結(jié)表述，包括疏水、氫鍵、靜電以及其他作用，明確受體蛋白中的各種氨基酸殘基與配體小分子之間的相互作用的數(shù)目以及每一種相互作用類型涉及數(shù)目排行靠前的氨基酸殘基。

(1)配體-蛋白相互作用的二維平面圖生成

該平面圖可顯示受體蛋白氨基酸殘基與配體對(duì)接構(gòu)型間的非鍵相互作用類型及距離等相關(guān)信息，便于我們更直觀的觀察兩者的相互作用及關(guān)鍵的氨基酸和基團(tuán)，以便分析對(duì)接結(jié)果。

(2)作用類型熱圖生成

對(duì)接完成后打開(kāi)DS中的Heat Map(Favorable)配體分子與受體蛋白之間的相互作用以熱圖的形式被展現(xiàn)出來(lái)。熱圖中包含了所有的對(duì)接構(gòu)象及相對(duì)應(yīng)的相互作用信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 揮發(fā)油主要成分小分子與受體蛋白結(jié)合情況

通過(guò)DS中的CDOCKER精準(zhǔn)分子對(duì)接技術(shù)模擬12種揮發(fā)油成分小分子與MAO-A受體蛋白模擬對(duì)接，對(duì)接結(jié)果中選取最優(yōu)對(duì)接構(gòu)象，并對(duì)能量排序見(jiàn)表2。CDOCKER對(duì)接主要計(jì)算配體小分子與受體蛋白總能量(CDOCKER_ENERGY)，配體-受體相互作用能量(CDOCKER_INTERACTION_ENERGY)，以此兩種能量做對(duì)接情況的參考，CDOCKER_ENERGY越小，說(shuō)明對(duì)接體系總能量低，對(duì)接體系穩(wěn)定，CDOCKER_INTERACTION_ENERGY越低，表示對(duì)接過(guò)程中相互作用小，兩者結(jié)合得越好。DS中對(duì)上述兩種能量數(shù)值取負(fù)數(shù)，故-CDOCKER_ENERGY越大，對(duì)接越穩(wěn)定， -CDOCKER_INTERACTION_ENERGY越大，配體與受體結(jié)合越好。取兩值之和并對(duì)其排序，可作為對(duì)接情況優(yōu)劣的參考依據(jù)。

表2 揮發(fā)油成分小分子與MAO-A對(duì)接結(jié)果Table 2 Docking results of volatile oil components and MAO-A

揮發(fā)油主要成分小分子均能與MAO-A對(duì)接成功，且與原配體肉葉蕓香堿相比較，有6種配體小分子對(duì)接結(jié)果較優(yōu)于原配體。其中前3種配體與受體蛋白結(jié)合二維平面圖如圖1～圖3所示。

圖1 木犀草素與MAO-A對(duì)接平面圖Fig.1 Figure of luteolin docking with MAO-A

圖2 香葉木素與MAO-A對(duì)接平面圖Fig.2 Figure of vanillin docking with MAO-A

圖3 迷迭香酸與MAO-A結(jié)合Fig.3 Figure of rosmarinic acid docking with MAO-A

2.2 天然藥物小分子與受體的各種作用力

配體分子與受體蛋白的各種作用力統(tǒng)計(jì)與各種作用數(shù)量前五的殘基計(jì)數(shù)見(jiàn)表3。

表3 全類型作用總計(jì)Table 3 Total Interaction count

對(duì)接過(guò)程中各種對(duì)接形態(tài)配體與受體蛋白中產(chǎn)生氫鍵作用的殘基共有258個(gè)，產(chǎn)生疏水作用的有562個(gè)，靜電作用的有42個(gè)，其中產(chǎn)生氫鍵數(shù)目排行前五的氨基酸殘基為：TYR69、TYR444、GLY67、ALA68 、TYR407；產(chǎn)生靜電相互作用的殘基數(shù)目排行前五的氨基酸殘基為：LYS305、ARG51、GLU216、TRP397、PHE352；產(chǎn)生疏水作用的殘基數(shù)目排行前五的氨基酸殘基為：TYR407、TYR444、ARG51、MET445、 CYS406。產(chǎn)生其他作用的殘基有CYS406與MET445。

對(duì)接中全部配體與受體產(chǎn)生的所有作用如圖4所示，可見(jiàn)各配體與氨基酸殘基互相作用數(shù)目熱度，其中互相作用熱度較高的有ARG51、TYR69、GLY66、TYR407等?？芍狹AO-A蛋白的活性空腔大致由上述殘基共同構(gòu)成，且其中氨基酸殘基TYR407熱度較高，可知其在結(jié)合過(guò)程中是關(guān)鍵殘基[17]。

圖4 配體與受體相互作用熱圖Fig.4 Heat map of ligand-receptor interaction

2.3 數(shù)據(jù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

除DS中的對(duì)接結(jié)果中的能量數(shù)據(jù)之外，研究結(jié)果[17]表明MAO-A的活性中心結(jié)合的關(guān)鍵在于與氨基酸殘基Phe208、ASn181、Tyr407產(chǎn)生相互作用，而本研究選用的MAO-A(PDBID:2z5x)的原配體肉葉蕓香堿與氨基酸殘基Tyr407形成π-π堆積作用，也從一定程度說(shuō)明了配體小分子與上述殘基的相互作用是配體小分子與受體蛋白活性中心結(jié)合的關(guān)鍵，故可從配體分子與殘基的作用情況與結(jié)合的數(shù)據(jù)結(jié)果分析配體小分子是否能與受體蛋白活性中心結(jié)合。根據(jù)結(jié)合作用熱圖可知，TYR407熱度較其他殘基更高，表明對(duì)接結(jié)果數(shù)據(jù)可靠。

3 結(jié) 論

本研究從已知的天然藥物揮發(fā)油成分中選擇可能具有抗抑郁成分12種，與受體蛋白原配體肉葉蕓香堿對(duì)比結(jié)果分析，共有6種對(duì)接結(jié)果得分高于原配體，天然藥物揮發(fā)油活性小分子作為抑制劑進(jìn)入受體“口袋”形成空間位阻效應(yīng)，最終抑制MAO-A，阻止腦內(nèi)5-HT和NE降解，同時(shí)提升腦內(nèi)突觸間隙5-HT和NE的濃度，起到一定的抗抑郁作用。

以本次對(duì)接結(jié)果中能量高低排序，得分較高的3種小分子為例：

木犀草素與MAO-A中的TYR407氨基酸殘基可產(chǎn)生T型的π-π堆積作用(Pi-Pi T-shaped)，與GLY66、TYR44、TYR69等氨基酸殘基構(gòu)成的活性空腔相結(jié)合；

香葉木素環(huán)狀結(jié)構(gòu)與MAO-A中的TYR407、TYR444產(chǎn)生π-π堆積作用，酚羥基與LYS305起Salt Bridge作用；

迷迭香酸中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)與殘基TYR69產(chǎn)生T型π-π堆積作用(Pi-Pi T-shaped)，兩個(gè)甲基與TYR407產(chǎn)生Pi-Alkyl作用。

就以上三種對(duì)接能量得分較高的配體小分子對(duì)接情況而言，均能與TYR407殘基產(chǎn)生π-π堆積作用，且能與關(guān)鍵氨基酸殘基構(gòu)成的活性空腔良性結(jié)合，可能是其對(duì)接能量得分較高的原因之一。

研究中選用的12種小分子多數(shù)存在于天然藥物揮發(fā)油中，且來(lái)源并不單一，對(duì)接得分較高的幾種配體在臨床中抗抑郁活性有待進(jìn)一步活體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，對(duì)接得分不高的配體也可能通過(guò)其他途徑起抗抑郁作用，同樣能起到抗抑郁作用的受體蛋白還有多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)、5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERT)等，抗抑郁作用機(jī)制并非單一渠道，與MAO-A作用只是其中一種抗抑郁途徑，計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接結(jié)果可為天然藥物揮發(fā)油抗抑郁研究提供理論導(dǎo)向，為抑郁癥新藥研發(fā)提供新的思路。