高正松，王保成，徐松泉，李 歡

(南京威爾藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇 南京 210042)

磷脂是磷酸的二酯類化合物，以天然磷脂酰膽堿為例，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 天然磷脂酰膽堿Fig.1 Natural phosphatidylcholine

式中R1、R2為兩種相同或不相同的脂肪酸，所以磷脂酰膽堿是二脂肪酸甘油和膽堿與磷酸組成的二酯類化合物。如果用R1O-代表1,2-二脂肪酸甘油酯，R2O-代表膽堿，則廣義的磷脂分子結(jié)構(gòu)式可用圖2的結(jié)構(gòu)式表示。

圖2 廣義磷脂結(jié)構(gòu)式Fig.2 Generalized phospholipid structure

逆向合成分析是研究有機合成路線的基本方法，即先把分子中某些鍵切斷，合理地分割成幾個結(jié)構(gòu)單元，然后再利用某類反應(yīng)把切割得到的結(jié)構(gòu)單元結(jié)合在一起，最后得到目標分子。根據(jù)這一方法，磷脂分子可以切割成三塊：兩種一元醇R1OH、R2OH以及磷酸，切割途徑如圖3所示。切割后的R1OH可以代表各種直鏈或支鏈的脂肪醇、甘油二脂肪酸酯、糖類化合物及含一個羥基的雜環(huán)類化合物。

圖3 磷脂的切割Fig.3 Cleavage of phospholipids

其中，R2OH代表膽堿、乙醇胺(氨基被保護)、環(huán)己六醇(五個羥基被保護)、絲氨酸(氨基需保護)及其它多糖類等復(fù)雜化合物。膽堿的工業(yè)品是氯化膽堿，氯化膽堿用于合成磷脂時，收率不高，所以常常將氯化膽堿轉(zhuǎn)化為膽堿乙酸鹽或?qū)妆交撬猁}后使用。乙醇胺在合成磷脂前，因為氨基與羥基存在反應(yīng)的競爭性，故需要將氨基進行保護，成為芐氧羰基乙醇胺(Cbz-NHCH2CH2OH)、叔丁氧羰基乙醇胺(N-Boc-ethanolamine)或N-三苯甲基乙醇胺(2-Tritylaminoethanol)。

磷脂切割后的第三部分是磷酸，由于磷酸的反應(yīng)活性不高，通常需要較高的反應(yīng)溫度，且會產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物，所以在磷脂的合成過程中通常選擇三氯氧磷、三氯化磷、亞磷酸以及這些化合物的衍生物。這些衍生物包括氯磷酸酯類化合物、2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷(2-chloro-2-oxo-1,3,2-dioxa-phospholane)、亞磷酰胺，其中最有代表性的是二異丙氨基氯化亞磷酸甲酯(N,N-diisopropylamidomethylchlorophosphite)、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷雜環(huán)戊烷-4-酮(2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicylchlorophosphite)以及Still-Gennari試劑等。

磷脂是磷酸二酯，合成時需經(jīng)過二次酯化，第一次酯化是R1OH與三氯氧磷、三氯化磷及其衍生物酯化，得到中間體，二次酯化是R2OH與中間體酯化，后處理后得到磷脂。磷脂也可以通過逆向法合成，即R2OH先與三氯氧磷、三氯化磷及其衍生物酯化，制得中間體，然后中間體與R1OH酯化，得到產(chǎn)物。合成路線不同，產(chǎn)生的中間體也不同。本文從不同的合成路線出發(fā)，介紹了幾種磷脂的合成方法。

1 以磷脂酰二氯合成磷脂

1996年，Masami Ishihara和Atsunori Sano報道了用二脂肪酸甘油酯與三氯氧磷反應(yīng)，制備了二脂肪酸甘油磷酰二氯，并以定量收率成功分離得到了二棕櫚酸甘油磷酰二氯。二棕櫚酸甘油磷酰二氯與膽堿對甲苯磺酸反應(yīng)，得到了二棕櫚酸甘油磷脂酰膽堿(DPPC)，以二硬脂酸甘油酯代替二棕櫚酸甘油酯進行反應(yīng)，成功得到了二硬脂酸甘油磷脂酰膽堿(DSPC)(圖4)[1]。

圖4 用磷脂酰二氯合成DSPCFig.4 Synthesis of DSPC with phosphatidyl dichloride

該反應(yīng)的第一步以氯仿作為溶劑，用三乙胺吸收反應(yīng)生成的氯化氫，制備得到了中間體L2。第二步在吡啶作為溶劑下，中間體L2與膽堿對甲苯磺酸鹽進行反應(yīng)制備了中間體L3，中間體L3在10% Na2CO3溶液中，以57%的收率得到了終產(chǎn)物DSPC，以61.3%的收率得到了終產(chǎn)物DPPE。當用氯化膽堿代替膽堿對甲苯磺酸鹽進行合成時，終產(chǎn)物的收率只有1.4%。用本方法合成磷脂時，中間體L2可以不分離，一步合成磷脂酰膽堿。將此方法應(yīng)用于合成其他磷脂酰膽堿時，收率并不理想[2-3]。

該方法同樣適用于制備DSPE：通過二硬脂酸甘油酯與三氯化磷反應(yīng)，制得中間體二硬脂酸甘油磷酰二氯，無需經(jīng)過分離，制得的二硬脂酸甘油磷酰二氯直接與芐氧羰基乙醇胺縮合，鈀碳氫化脫芐，得到DSPE(圖5)[4]。

圖5 用磷脂酰二氯合成DSPEFig.5 Synthesis of DSPE with phosphatidyl dichloride

用叔丁氧羰基乙醇胺代替芐氧羰基乙醇胺縮合，三氟乙酸脫保護基，同樣可以制得DSPE[5]。在此之前，石藥集團已經(jīng)公開了合成DSPE的專利[6-8]。

2 以磷酸酯合成磷脂

在以往的文獻報道中，二脂肪酸甘油磷酸酯的合成方法有三種。

2.1 三氯氧磷法[9]

二棕櫚酸甘油酯與三氯氧磷反應(yīng)制得磷酰二氯，加水水解，產(chǎn)物用乙醚提取，正己烷結(jié)晶，得到二棕櫚酸甘油磷酸酯，收率76%(圖6)。

圖6 三氯氧磷法制備二棕櫚酸甘油磷酸酯Fig.6 Preparation of glyceryl dipalmitate using phosphorus oxychloride

Guggulsterol用此法制備了Guggulphosphatidic acid[10](圖7)。

圖7 用三氯氧磷做試劑制備古格磷酸酯Fig.7 Preparation of guggulphosphatidic acid using phosphorus oxychloride

2.2 亞磷酰胺法[11]

2007年，Porter等[11]報道了一種制備磷脂的新方法。該方法首先通過1,2-二取代甘油與N,N-二異丙基亞磷酰胺二叔丁酯在乙腈中，通過四氮唑催化，得到亞磷酸酯。亞磷酸酯在間氯過苯甲酸的氧化下，得到磷酸二叔丁酯。磷酸二叔丁酯利用三氟乙酸脫叔丁基，最終得到磷酸酯PLPA。該方法的化學(xué)反應(yīng)方程式如圖8所示。

圖8 磷酸酯PLPA的合成Fig.8 The synthesis of PLPA

2.3 氯磷酸酯法[12-14]

2018年，Strauss等[13]報道了利用氯磷酸二芐酯成功合成了含有酰胺鍵的磷酸脂(圖9)。同年，Raushel等[12]同樣利用氯磷酸二芐酯，大量合成了磷酸酯底物，用于磷酸三酯酶的切割位點研究。糖類及多糖類化合物作為原料制備磷酯時，同樣可以利用氯磷酸酯作為反應(yīng)物進行反應(yīng)，例如Minnaard等[15]在2006年以甘露糖四乙酸酯為原料，用此方法制備了磷酸酯吡啶鹽。與之前不同的是，Minnaard選擇的氯磷酸酯為磷酸二苯酯，而非磷酸二芐酯。用磷酸二苯酯制備磷酸酯時，催化氫化脫苯基的催化劑是PtO2。用此法制備的1,2-二硬脂酸甘油磷酸酯，進一步與膽堿對甲苯磺酸鹽反應(yīng)，即可合成DSPC[16]。

圖9 用氯磷酸二芐酯合成磷酸脂F(xiàn)ig.9 Synthesis of phosphate ester using dibenzyl chlorophosphate

圖10 用氯磷酸二苯酯合成磷酸酯吡啶鹽Fig.10 Synthesis of pyridine phosphate with diphenyl chlorophosphate

用二脂肪酸甘油磷酸酯合成磷脂時，通常需要使用縮合試劑，常用的縮合劑有三異丙基苯磺酰氯(TPSCl)，叔戊酰氯(PivCl)等。早在1971年，R Aneja和J S Chadha就用二脂肪酸甘油磷酸酯與肌醇五芐醚合成磷脂，縮合物催化脫芐后，制得磷脂酰肌醇，化學(xué)反應(yīng)方程式如圖11所示。二硬脂酸甘油磷酸酯與膽堿乙酸鹽在同樣的條件下可制得二硬脂酸甘油磷脂酰膽堿(DSPC)(圖12)[14,16-18]。二硬脂酸甘油磷酸酯與N-Trityl氨基乙醇反應(yīng)，產(chǎn)物脫芐，可制得二硬脂酸甘油磷酸酯乙醇胺(DSPE)(圖13)[19]。

圖11 磷脂酰肌醇的合成Fig.11 Synthesis of phosphatidylinositol

圖12 DSPC的合成Fig.12 Synthesis of DSPC

圖13 DSPE的合成Fig.13 Synthesis of DSPE

3 以2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷合成磷脂[20-23]

2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷(COP)作為合成磷脂的重要反應(yīng)物，是由三氯化磷和乙二醇為原料，通過兩步反應(yīng)制得。反應(yīng)方程式如圖14所示，三氯化磷和乙二醇在惰性氣體保護下，二氯甲烷溶液中室溫反應(yīng)3 h，可得2-氯-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷(CP)，CP在苯作為溶劑下，與氧氣在回流條件下反應(yīng)，即可得到2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷(COP)[24-32]。所得的2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷與二脂肪酸甘油酯進行縮合，縮合后所得的產(chǎn)物利用三甲胺胺化，即可得到磷脂酰膽堿，化學(xué)反應(yīng)方程式如圖15所示。環(huán)狀化合物用胺進行胺化，副產(chǎn)物多，收率低。2010年，華東師范大學(xué)的羅宇等[33]發(fā)明了利用疊氮化鈉開環(huán)，再用氫氣還原疊氮化物制備磷脂酰乙醇胺的方法(圖16)。

圖14 2-氯-2-氧-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷的合成Fig.14 Synthesis of 2-chloro-2-oxo-1,3,2-dioxocyclopentane

圖15 磷脂酰膽堿的合成Fig.15 Synthesis of phosphatidylcholine

圖16 利用疊氮化鈉制備磷脂酰乙醇胺Fig.16 Preparation of phosphatidylethanolamine with NaN3

4 以亞磷酰胺類化合物合成磷脂

亞磷酰胺類化合物是三氯化磷的衍生物，種類繁多，其分子結(jié)構(gòu)如圖17A所示。式中a、b、c為三氯化磷分子中保留的或被取代的基團，如-Cl, -N(iPr)2, -OCH3, -OC(tBu)3, -OCH2CH2CN, -OCH2C6H5等。其中最有代表性的亞磷酰胺類化合物是二異丙胺基氯化亞磷酰胺甲酯，分子結(jié)構(gòu)式如圖17B所示。以三氯化磷為原料，經(jīng)過兩步反應(yīng)，即可制得二異丙氨基氯化亞磷酰胺甲酯[34-39]，反應(yīng)方程式如圖18所示。

圖17 亞磷酰胺類化合物Fig.17 Phosphoramidites

圖18 二異丙氨基氯化亞磷酰胺甲酯的合成Fig.18 Synthesis of methyl diisopropylamino phosphoramidite

亞磷酰胺分子中，三個取代基團的活性不同，P-Cl具有最大的活性，在室溫就能與醇類化合物(如二硬脂酸甘油)反應(yīng)，生成亞磷酸酯。相對而言，P-N鍵要穩(wěn)定一點，在1H-四氮唑催化條件下，也能與醇類化合物反應(yīng)，如氨基已被保護的乙醇胺。烷氧基(-OR)是穩(wěn)定的，相當于一種保護基團，通常情況下不參與反應(yīng)。

以亞磷酰胺類化合物合成磷脂，是一種合成磷脂的通用方法[40]，選擇合適的亞磷酰胺化合物做試劑，可以成功合成磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺以及其它多種磷脂, 合成過程見圖19。合成主要分四步，第一步氯化二異丙氨基亞磷酰胺甲酯與醇R1OH反應(yīng)，生成化合物1，化合物1接著與R2OH反應(yīng)，生成化合物2，化合物2用間氯過苯甲酸或叔丁基過氧化氫氧化，把P(Ⅲ)氧化成P(Ⅴ)，最后用碘化鉀脫甲基，得到最終產(chǎn)物。有關(guān)用亞磷酰胺類化合物合成磷脂的方法，可以參考其相關(guān)文獻[25,40-44]。

圖19 利用亞磷酰胺類化合物合成磷脂F(xiàn)ig.19 Synthesis of phospholipids with phosphoramidites

5 以H-磷酸(鹽)合成磷脂

用H-磷酸酯合成磷脂是近期發(fā)展起來的一種方法，與前面介紹的幾種方法相比，有諸多優(yōu)點。首先，傳統(tǒng)合成磷脂所用的試劑三氯化磷和三氯氧磷分子中的P-Cl鍵很活潑，不穩(wěn)定，因此不易操作。H-磷酸酯分子中沒有氯原子，在空氣中不會因吸收水汽而水解，也不會氧化，所以很穩(wěn)定，也易于貯存；其次，三氯化磷和三氯氧磷分子中有三個P-Cl鍵，反應(yīng)不可能停止在單酯階段，副產(chǎn)物多，而H-磷酸酯分子中已經(jīng)沒有氯原子，而且分子中只有一個羥基，只能生成單酯，酯化反應(yīng)收率比更高，制備H-磷酸酯的收率一般在90%以上；酯化條件與磷酸酯合成磷脂條件相同，同樣需要偶合試劑，如叔戊酰氯，而且反應(yīng)很快，約5分鐘即可完成；酯化后，需要把三價磷氧化成五價磷，氧化過程常用碘/水(吡啶)溶液，非常方便[45]。

H-磷酸酯的制備方法有以下三種：

(1)羥基化合物與三氯化磷及咪唑反應(yīng)。當羥基化合物為二硬脂酸甘油酯時，便可制得1,2-二硬脂酸甘油-3-H-磷酸三乙胺鹽(圖20)[46-50]。

圖20 1,2-二硬脂酸甘油-3-H-磷酸三乙胺鹽的合成Fig.20 Synthesis of glycerol-3-H-triethylamine phosphate

(2)亞磷酸吡啶鹽制備H-磷酸酯[51-52]。吡啶先與亞磷酸反應(yīng)，得到亞磷酸吡啶鹽，亞磷酸吡啶鹽再與羥基化合物進行反應(yīng)，即可得到H-磷酸酯(圖21)。

圖21 亞磷酸吡啶鹽制備H-磷酸酯Fig.21 Preparation of H-phosphate with pyridinium

(3)用氯化亞磷酸水楊酯(salicyl chlorophosphite，SaiOCl)制備H-磷酸酯[53-55]。氯化亞磷酸水楊酯與羥基化合物在四氫呋喃溶液中，在吡啶存在下，室溫反應(yīng)3小時即可定量得到H-磷酸酯(圖22)。

圖22 用氯化亞磷酸水楊酯制備H-磷酸酯Fig.22 Preparation of H-phosphate with salicyl chlorophosphite

用H-磷酸酯合成磷脂的通用方法如圖23所示[56]。當羥基化合物為膽堿對甲苯磺酸鹽和Boc-氨基乙醇時，DPPC的收率80%，DPPE的收率86%。用此方法合成DSPE的收率77%[57]。此外H-磷酸酯被廣泛應(yīng)用于合成多糖類及其它復(fù)雜分子組成的磷脂[46-47,50-51,58]。

圖23 H-磷酸酯合成磷脂的通用方法Fig.23 General method for synthesis of phospholipids with H-phosphate

6 Still-Gennari 試劑合成磷脂

2015年Shigeki Sano等[59]利用Still-Gennari 試劑(圖24，化合物1)與雙十六烷基甘油及N-Boc乙醇胺反應(yīng)，然后在酸性條件脫除Boc保護基，即可得到磷脂酰乙醇胺(圖24)。選用合適的試劑，此法可以用于合成DSPE及DSPC[60]。

圖24 Still-Gennari 試劑合成磷脂F(xiàn)ig.24 Synthesis of phospholipids with Still-Gennari regnets

7 結(jié) 語

合成磷脂為了彌補天然磷脂在市場的空缺，經(jīng)過科學(xué)研究者多年的努力，已取得了飛速的發(fā)展?？偨Y(jié)上述合成路線，以DSPC和DSPE的合成為例，現(xiàn)將六條合成路線總結(jié)如下。本文歸納的這六條磷脂合成路線，為后續(xù)DSPC、DSPE以及其他類型的磷脂合成提供了參考，并為開發(fā)新型結(jié)構(gòu)的磷脂提供了可能，具有廣闊且深遠的意義。

圖25 DSPC和DSPE的合成總結(jié)圖Fig.25 Synthetic summary diagram of DSPC and DSPE