康小紅，李周勇，陳建國，韓雪，張?zhí)m威，3

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)工程學(xué)院，哈爾濱150090；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司研發(fā)中心，呼和浩特011500；3.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

0 引 言

嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002是一株高產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵菌株，菌種保藏號為CGMCC No.3817[1]，該菌株不僅具備作為發(fā)酵劑的良好特征，而且通過前期的探索試驗，我們還發(fā)現(xiàn)MN-ZLW-002可以促進(jìn)共生菌的生長。雙歧乳桿菌Bb12于2007年通過我國衛(wèi)生部安全性評估[2]，已證實具有調(diào)節(jié)人體腸道菌群和提高人體免疫力的功效[3]，此后被廣泛添加于乳制品中。隨著我國乳制品行業(yè)市場規(guī)模的逐漸擴(kuò)大，對Bb12益生菌的需求量也在逐年遞增，伴隨Bb12廣泛應(yīng)用的是菌種成本的不斷增加[4]。因此，試驗對嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002體外促Bb12生長作用進(jìn)行了研究，通過對比MRS液體培養(yǎng)基和發(fā)酵乳中Bb12活菌數(shù)的變化以及酸奶的感官測評，確定嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002與Bb12最佳的應(yīng)用復(fù)配比例。同時，從培養(yǎng)基中溶氧值的變化情況及MN-ZLW-002發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖含量的角度對相關(guān)機(jī)理進(jìn)行了初步研究[5]，為嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002，蒙牛提供；乳雙歧桿菌Bb12，科漢森；商業(yè)發(fā)酵劑L903，科漢森提供。

脫脂乳粉，雀巢；鮮牛乳，蒙?，F(xiàn)代牧廠；MN-ZLW-002菌株胞外多糖（粗提物）；蔗糖、氫氧化鈉；M 17瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、TPY瓊脂培養(yǎng)基，均由北京陸橋提供；其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 試驗設(shè)備

2000237電熱恒溫培養(yǎng)箱，西班牙J.P.SELECTA公司；ALPHA 1-4 LD plus真空冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；BioStatB生物發(fā)酵罐，德國貝朗公司；G560E漩渦混合器，美國SCIENTIFIC Instruments公司；Premium U 410超低溫冰箱，美國NBS公司；PB-10 pH計，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；CP21GⅡ高速冷凍離心機(jī)，日立公司；ML51生物顯微鏡，日本Olympus公司；SVE-6A1超凈工作臺，新加坡ESCO公司；Handylab multi12溶氧儀，德國SCHOTT Instruments公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 MN-ZLW-002在MRS液體培養(yǎng)基中對Bb12生長的影響

凍存的嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002經(jīng)常溫下復(fù)溫2 h后，接種于M 17液體培養(yǎng)基，乳雙歧桿菌Bb12接種于TPY液體培養(yǎng)基[6]，兩菌株均于37℃條件培養(yǎng)18～24 h，2%接種量活化兩代，分別對活化好的MN-ZLW-002和Bb12進(jìn)行菌落計數(shù)。隨后，將活化好的MN-ZLW-002及Bb12進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配菌及Bb12單菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，按預(yù)試驗結(jié)果調(diào)整MN-ZLW-002和Bb12最終濃度為106和104CFU/mL，37℃進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第8、16、24 h對混合發(fā)酵的Bb12和單獨發(fā)酵的Bb12進(jìn)行采樣計數(shù)[7]。試驗共進(jìn)行三批次實驗，每批次實驗采集數(shù)據(jù)三次（n=3），試驗分組如下。

表1 試驗分組及接菌量

1.3.2 MN-ZLW-002在發(fā)酵乳中促Bb12生長研究

試驗先將商業(yè)化酸奶發(fā)酵劑L903及雙歧桿菌Bb12按固定接菌量接入已滅菌的鮮牛乳中，并以不同接菌量接入MN-ZLW-002單菌株，于43℃發(fā)酵，發(fā)酵終點p H控制為4.50，待到發(fā)酵終點后將酸奶破乳打冷，經(jīng)后熟12 h后于4℃條件下貯藏[8]。通過對過程中酸奶的發(fā)酵特性及酸奶樣品的感官屬性進(jìn)行對比[9]，研究MN-ZLW-002與Bb12的最佳復(fù)配比例。通過發(fā)酵后及21 d貯藏期間雙歧桿菌活菌數(shù)的變化，研究MN-ZLW-002菌株在發(fā)酵乳中對乳雙歧桿菌Bb12生長的影響。具體試驗組別及接菌量見表2。

表2 不同試驗組別及接菌量

1.3.3 溶氧值對MN-ZLW-002與Bb12共生關(guān)系的影響

MN-ZLW-002菌株對培養(yǎng)基及發(fā)酵乳中雙歧桿菌存活性影響試驗表明，MN-ZLW-002菌株對酸奶中的雙歧桿菌Bb12具有一定的促生長作用，MN-ZLW-002菌株屬于兼性厭氧菌，雙歧桿菌為厭氧菌[10]，試驗擬從發(fā)酵過程中培養(yǎng)基溶氧值變化的角度初步探索該現(xiàn)象的原因[11]。

分別利用乳雙歧桿菌Bb12單菌發(fā)酵及Bb12與MN-ZLW-002混合發(fā)酵12%脫脂乳，Bb12接菌量為50 g/t，MN-ZLW-002與Bb12按上一步試驗確定的最佳比例復(fù)配，發(fā)酵溫度為43℃，發(fā)酵時間24 h，對發(fā)酵過程中酸奶的pH值、溶氧值以及球桿菌數(shù)進(jìn)行采集，分析溶氧值對MN-ZLW-002與Bb12共生關(guān)系的影響。

1.3.4 MN-ZLW-002胞外多糖對Bb12的影響

嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002是一株高產(chǎn)胞外多糖的菌株[12]，稱取MN-ZLW-002菌株發(fā)酵脫脂乳的胞外多糖粗提物于MRS液體培養(yǎng)基中，最終制得胞外多糖-MRS液體培養(yǎng)基，并使胞外多糖終濃度為160 mg/L，115℃高壓滅菌15 min，備用。

將Bb12菌株活化3代后（37℃厭氧培養(yǎng)18 h），接入胞外多糖-MRS液體培養(yǎng)基及普通MRS液體培養(yǎng)基，接菌量均為1×106CFU/mL（模擬實際生產(chǎn)接菌量），于37℃厭氧培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第0、2、4、8、16、24 h取樣計數(shù)，分析MN-ZLW-002代謝產(chǎn)生的胞外多糖對Bb12生長的影響。

1.3.5 其它指標(biāo)測定方法

（1）發(fā)酵時間[13]

采用乳品發(fā)酵監(jiān)控儀連續(xù)測定樣品pH值，以0.5 h為最小單位，記錄樣品p H值降低到4.50所用的時間，即為樣品發(fā)酵時間。

（2）活菌數(shù)測定[14]

按GB4789.35采用MC瓊脂培養(yǎng)基對嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002進(jìn)行活菌計數(shù)（37℃需氧培養(yǎng)72 h，記錄菌落數(shù)）；按GB4789.35采用莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS培養(yǎng)基對乳雙歧桿菌Bb12進(jìn)行活菌計數(shù)（37℃厭氧培養(yǎng)72 h，記錄菌落數(shù)）。

（3）黏度測定[15]

黏稠度的測定采用LVDV-Ⅱ旋轉(zhuǎn)式黏度計進(jìn)行，通過前期預(yù)試驗，選擇62號轉(zhuǎn)子，50 rpm，在4℃條件下，測定10 s計數(shù)。照此方法重復(fù)測量3次取平均值，黏稠度單位為mPa·s。

（4）酸奶感官測評

由20名蒙牛集團(tuán)研發(fā)中心感官品評小組成員，對發(fā)酵乳樣品的總體感官（包括色澤、口感及滋氣味等）進(jìn)行評價?？偡指哂?0的，為優(yōu)質(zhì)酸奶；總分介于80至90之間的，為良質(zhì)酸奶；總分低于80的，為次質(zhì)酸奶。酸奶感官評定標(biāo)準(zhǔn)如下表所示。

表3 酸奶感官評定標(biāo)準(zhǔn)[16]

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002對培養(yǎng)基中Bb12存活率的影響實驗

試驗將MN-ZLW-002和Bb12的復(fù)配菌及Bb12單菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的第8、16及24 h對混合發(fā)酵樣品中的Bb12和單獨發(fā)酵樣品的Bb12進(jìn)行采樣計數(shù)。試驗結(jié)果如表4所示。

表4 Bb12菌落計對數(shù)值及t檢驗結(jié)果

由表4可見，Bb12與MN-ZLW-002混合培養(yǎng)8 h的Bb12菌落數(shù)對數(shù)值小于Bb12單獨培養(yǎng)菌落數(shù)對數(shù)值，差異極顯著（P＜0.01）；Bb12與MN-ZLW-002混合培養(yǎng)16 h及24 h的Bb12菌落數(shù)對數(shù)值與Bb12單獨培養(yǎng)菌落數(shù)對數(shù)值相比較，混合培養(yǎng)的值均大于對應(yīng)時間的單獨發(fā)酵的值，其中8 h差異顯著（P＜0.05），24 h且差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 Bb12菌落計數(shù)結(jié)果

以上試驗結(jié)果表明，MN-ZLW-002有促進(jìn)Bb12增殖的作用，在混合培養(yǎng)8 h時兩株菌處于競爭生長狀態(tài)，故混合培養(yǎng)Bb12菌落對數(shù)值小于單獨培養(yǎng)[17]，此后的16～24 h混合培養(yǎng)的Bb12菌落計數(shù)迅速提高，且顯著高于單獨培養(yǎng)的Bb12菌落對數(shù)值，說明MNZLW-002對Bb12的增殖產(chǎn)生了有效的促進(jìn)作用。

2.2 MN-ZLW-002菌株對發(fā)酵乳中雙歧桿菌生長的影響

2.2.1 MN-ZLW-002對酸奶發(fā)酵特征及感官特征的影響

試驗在商業(yè)發(fā)酵劑L903及雙歧桿菌Bb12按固定接菌量接入滅菌鮮牛乳的基礎(chǔ)上，接入不同比例的MN-ZLW-002單菌株，于43℃發(fā)酵，通過對過程中酸奶的發(fā)酵特征進(jìn)行對比監(jiān)測，以及對酸奶樣品進(jìn)行感官測評，研究MN-ZLW-002與Bb12的最佳復(fù)配比例。試驗結(jié)果如表5所示。

表5 MN-ZLW-002不同接菌量酸奶的發(fā)酵特征

表6 發(fā)酵乳樣品感官測評結(jié)果

由以上試驗結(jié)果可知，各實驗組酸奶樣品發(fā)酵時間基本維持在4 h，僅樣品3即MN-ZLW-002與Bb12按1∶100復(fù)配組酸奶樣品發(fā)酵較慢，為4.5 h。各試驗組酸奶經(jīng)后熟12 h后，樣品后熟p H值與對照組相比無明顯差異；各試驗組樣品后熟黏度均明顯提高，與對照組相比差異顯著，表明嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002具有明顯的產(chǎn)黏特性，可顯著提高產(chǎn)品的黏稠度。后酸方面，各組酸奶在4℃條件下貯藏21 d后，1∶10組（試驗組4）pH值變化最大，其次為1∶100組（試驗組3），均與對照組差異顯著，其余組與對照組相比無明顯差異，表明過量的MN-ZLW-002添加會造成產(chǎn)品后酸過高。

感官測評方面，各組酸奶樣品均呈現(xiàn)出均勻的乳白色，有明顯的自然光澤。添加MN-ZLW-002菌株的酸奶后熟黏稠度均高于對照組，品嘗結(jié)果顯示試驗組3及試驗組4口感過于黏稠，且有明顯的酸感。感官測評總分表明，適當(dāng)少量的添加MN-ZLW-002不會對產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生不利影響，黏稠度的適當(dāng)提高反而有利于產(chǎn)品口感，表現(xiàn)為試驗組1和試驗組2感官總分與對照相比略有提高，但差異不顯著。當(dāng)MN-ZLW-002添加量過多時，產(chǎn)品黏稠度過高，酸感過強(qiáng)，不利于產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)和口感。試驗結(jié)果表明，當(dāng)MN-ZLW-002與Bb12按1×105和1∶1×103復(fù)配時，酸奶的發(fā)酵特征不受影響，且酸奶的組織狀態(tài)和口感略有提升。

2.2.2 發(fā)酵酸奶貯藏期內(nèi)Bb12生長情況

各試驗組酸奶樣品經(jīng)發(fā)酵后熟后，于4℃條件下進(jìn)行21 d貨架期貯藏，通過觀察各組酸奶樣品中乳雙歧桿菌Bb12的活菌數(shù)變化，分析MN-ZLW-002菌株在發(fā)酵乳中對乳雙歧桿菌Bb12生長的影響。試驗結(jié)果如表7所示。

表7 發(fā)酵酸奶貯存期雙歧桿菌活菌數(shù)對數(shù)值

由表7我們可以看到，以不同接菌量接入MN-ZLW-002菌株后，對酸奶中的乳雙歧桿菌Bb12均有顯著的促增殖作用，其中MN-ZLW-002與Bb12為1∶10（試驗組4）的促增殖作用最好，Bb12的活菌數(shù)最高，且酸奶于4℃條件下貯藏21 d的雙歧桿菌活菌數(shù)一直保持在108CFU/mL，比對照組高一個數(shù)量級；當(dāng)MN-ZLW-002與Bb12為1∶100（試驗組3）和1∶1000（試驗組2）時，發(fā)酵酸奶于4℃條件下貯藏14 d內(nèi)雙歧桿菌活菌數(shù)一直保持在108CFU/mL，雖然在第21 d時雙歧桿菌活菌數(shù)降低到107CFU/mL，但是整體數(shù)量仍顯著高于對照組（P＜0.05）；當(dāng)MN-ZLW-002與Bb12為1∶1×105（試驗組1）時，酸奶自貯藏期7 d后，雙歧桿菌活菌數(shù)與對照組相比無明顯差異。

綜合分析MN-ZLW-002不同接菌量的酸奶發(fā)酵特性、后酸水平、感官屬性及貯藏期內(nèi)乳雙歧桿菌Bb12的活菌數(shù)變化情況，我們得出以下結(jié)論，當(dāng)MN-ZLW-002與Bb12以1∶10添加發(fā)酵時，具有更好的雙歧桿菌促增殖作用，但是發(fā)酵酸奶黏稠度過高，后酸比較嚴(yán)重，有待進(jìn)一步研究改善。當(dāng)MN-ZLW-002與Bb12添加比例為1∶1×103時產(chǎn)品質(zhì)量與對照無明顯差異，且雙歧桿菌活菌數(shù)顯著高于對 照 組（P＜0.05）。結(jié) 果 提 示 我 們，利 用MN-ZLW-002菌株對乳雙歧桿菌Bb12的促生長作用，少量添加MN-ZLW-002或可減少Bb12的初始接菌量，降低相關(guān)酸奶產(chǎn)品的雙歧桿菌成本。

2.3 溶氧實驗結(jié)果

試驗從發(fā)酵過程中培養(yǎng)基溶氧值變化的角度初步探索MN-ZLW-002菌株對酸奶中乳雙歧桿菌Bb12的促生長作用機(jī)理。分別利用乳雙歧桿菌Bb12單菌發(fā)酵及Bb12與MN-ZLW-002混合發(fā)酵12%脫脂乳，Bb12接菌量為50 g/t，MN-ZLW-002與Bb12按1∶1×103復(fù)配，43℃發(fā)酵24 h，對發(fā)酵過程中酸奶的pH值、溶氧值以及球桿菌數(shù)進(jìn)行采集，分析溶氧值對MN-ZLW-002與Bb12共生關(guān)系的影響，試驗結(jié)果如表8。

由表8可見，在混合培養(yǎng)的樣品中，嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002生長迅速，活菌數(shù)于4.5 h即達(dá)到108CFU/mL，脫脂乳的溶氧值也于4.5 h急速降至0.09。在此后的培養(yǎng)過程中，MN-ZLW-002菌株活菌數(shù)始終保持在108CFU/mL，溶氧值持續(xù)下降，自15 h達(dá)到最低值0.04并保持穩(wěn)定。乳雙歧桿菌Bb12的活菌數(shù)在發(fā)酵的前18 h均保持在107CFU/mL，第21 h開始增長至108CFU/mL。

表8 發(fā)酵過程中溶氧值及乳酸菌活菌檢測結(jié)果

在乳雙歧桿菌Bb12單獨培養(yǎng)過程中，溶氧值于發(fā)酵5 h達(dá)到最低并保持0.10不變，整個過程中雙歧桿菌活菌數(shù)均保持在107CFU/mL，但是在培養(yǎng)后期，活菌數(shù)略有下降。由此我們可以看出，脫脂乳中的氧氣含量對嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002及乳雙歧桿菌Bb12的生長都具有一定的影響。

進(jìn)一步由圖2、圖3可知，當(dāng)MN-ZLW-002菌株與雙歧桿菌Bb12混合培養(yǎng)時，發(fā)酵4.5 h溶氧值即降至0.09，此后溶氧值繼續(xù)下降，最低可達(dá)0.04。整個過程中嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002與乳雙歧桿菌Bb12均持續(xù)增長。乳雙歧桿菌Bb12單獨培養(yǎng)時，溶氧值于發(fā)酵5 h達(dá)到最低值，并且至21 h始終保持在0.10，24 h為0.08，整個過程中Bb12活菌數(shù)基本保持不變。

圖2 混合培養(yǎng)過程中溶氧值及乳酸菌計數(shù)變化曲線

圖3 單獨培養(yǎng)過程中溶氧值及乳酸菌計數(shù)變化曲線

嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002為兼性厭氧菌，而乳雙歧桿菌Bb12為厭氧菌，雖然Bb12在非絕對厭氧條件下也可以生長，但顯然絕對厭氧條件對其生長更為有利[18]。溶氧試驗結(jié)果證實，嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002與乳雙歧桿菌Bb12混合培養(yǎng)時，MN-ZLW-002菌株加速了培養(yǎng)基中氧氣含量的降低，脫脂乳溶氧值降低速度較乳雙歧桿菌Bb12單株培養(yǎng)更快，可使培養(yǎng)基較快的達(dá)到有利于乳雙歧桿菌Bb12生長的厭氧條件，從而促進(jìn)Bb12的生長。

2.4 MN-ZLW-002胞外多糖對Bb12生長的影響

嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002具有高產(chǎn)胞外多糖特性，經(jīng)培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件優(yōu)化后，其在脫脂乳中發(fā)酵，胞外多糖的產(chǎn)量可達(dá)320 mg/L[19]。試驗將活化好的Bb12菌株分別接入胞外多糖-MRS液體培養(yǎng)基及普通MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過觀察不同培養(yǎng)基中乳雙歧桿菌Bb12的生長情況，從MN-ZLW-002胞外多糖的角度研究嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002促Bb12生長的機(jī)理[20]，試驗結(jié)果如表9所示。

表9 不同培養(yǎng)基中Bb12活菌計數(shù)對數(shù)值

圖4 不同培養(yǎng)基中Bb12生長曲線

由以上圖表可見，乳雙歧桿菌Bb12在兩種培養(yǎng)基中的生長規(guī)律為，0～4 h為生長適應(yīng)期，從4 h開始進(jìn)入對數(shù)生長期，至16 h以后生長趨于平穩(wěn)。對不同培養(yǎng)基中Bb12的生長情況進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，胞外多糖-MRS培養(yǎng)基中，Bb12的活菌數(shù)在整個培養(yǎng)過程中始終高于普通MRS培養(yǎng)基，在24 h時高出0.5個數(shù)量級。因此，我們判斷嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002還可以通過發(fā)酵代謝產(chǎn)生的胞外多糖菌株對乳雙歧桿菌Bb12產(chǎn)生促生長作用。

3 結(jié) 論

試驗以Bb12的活菌數(shù)變化為評價指標(biāo)，分別在MRS液體培養(yǎng)基及發(fā)酵乳中對嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002促乳雙歧桿菌Bb12生長作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在MRS液體培養(yǎng)基中，MN-ZLW-002對Bb12的增殖產(chǎn)生了顯著的促進(jìn)作用（P＜0.05）。在發(fā)酵乳中，當(dāng)MN-ZLW-002與Bb12按活菌數(shù)1∶1000復(fù)配參與發(fā)酵時，酸奶的發(fā)酵特征不受影響、組織狀態(tài)和口感略有提升，且雙歧桿菌活菌數(shù)顯著提高（P＜0.05）。

試驗從發(fā)酵過程中培養(yǎng)基溶氧值變化的角度初步探索MN-ZLW-002菌株對酸奶中乳雙歧桿菌Bb12的促生長作用機(jī)理。結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002與乳雙歧桿菌Bb12混合培養(yǎng)時，MN-ZLW-002菌株加速了培養(yǎng)基中氧氣含量的降低，使培養(yǎng)基較快的達(dá)到有利于Bb12生長的厭氧條件，從而促進(jìn)Bb12的生長。另一方面，通過對比觀察Bb12菌株在胞外多糖-MRS液體培養(yǎng)基及普通MRS液體培養(yǎng)基中的生長情況，從MN-ZLW-002胞外多糖的角度研究了嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002促Bb12生長的機(jī)理，試驗結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌MN-ZLW-002還可以通過發(fā)酵代謝產(chǎn)生的胞外多糖對乳雙歧桿菌Bb12產(chǎn)生促生長作用。