趙謀明 馬 梅 蘇國(guó)萬(wàn) 鄭 淋 劉 洋

（華南理工大學(xué) 廣州510640）

飲酒是60 多種疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，在全球疾病主要風(fēng)險(xiǎn)因素中排名第三[1]。大量或慢性飲酒每年造成的死亡人數(shù)約占總死亡人數(shù)的5.9%（約330 萬(wàn)）[2]。面對(duì)如此高的酒精中毒死亡率，尋求有效的解酒護(hù)肝劑是人們的當(dāng)務(wù)之急。

正常情況下，進(jìn)入人體內(nèi)的乙醇90%以上是在脫氫酶系統(tǒng)-乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）的催化作用下完成代謝的。肝臟中ADH活力水平是人體乙醇代謝的關(guān)鍵，提高其活性可加速乙醇在體內(nèi)的代謝，促進(jìn)醒酒[3-4]。鄭連姬等[5]報(bào)道魔芋葡甘露聚糖可降低服用乙醇小鼠的血醇含量，通過(guò)提高ADH 活性加速酒精代謝，發(fā)揮其防醉解酒的作用。王潔[6]等研究發(fā)現(xiàn)中藥葛根、葛花和枳椇子混合物可降低急性酒精中毒小鼠的血醇含量，并且其作用機(jī)制與提高肝臟ADH 活性有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于解酒藥物的研究主要集中在傳統(tǒng)中藥的復(fù)方及初提物方面。

玉米黃粉是濕法生產(chǎn)玉米淀粉的主要副產(chǎn)物，其含有62%～74%的蛋白質(zhì)，主要成分為醇溶蛋白（68%）、谷蛋白（22%）、球蛋白（1.2%）和白蛋白[7-8]。玉米黃粉蛋白質(zhì)具有氨基酸組成不平衡、水溶性差的特點(diǎn)，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[9]。研究發(fā)現(xiàn)玉米黃粉經(jīng)蛋白酶處理后，其水溶性可明顯增加，并且水解物具有多種生理活性[10]，如降血壓[11]，抗氧化[12-13]，護(hù)肝[14]，促進(jìn)酒精代謝[15]等。其醒酒活性是1997年由日本學(xué)者Yamaguchi等[16]率先報(bào)道。郭輝[17]對(duì)玉米肽解酒機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，玉米肽在體外試驗(yàn)中能激活A(yù)DH，并指出玉米肽的醒酒機(jī)制與其激活A(yù)DH 有關(guān)。Ma[18]發(fā)現(xiàn)玉米混合肽和玉米純肽均能提高ADH 活性，加速酒精代謝。劉鵬[19]采用雙酶酶解玉米黃粉，得到的玉米肽對(duì)ADH 的激活率僅49.12%，蛋白質(zhì)回收率也只有34%。

木瓜蛋白酶是由木瓜蛋白酶及木瓜凝乳蛋白酶等組成的多酶混合體系，兼具外切及內(nèi)切作用。胰酶由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶等組成，所含的蛋白酶作用各有差異。其中，有的酶專一作用于特定的肽鍵，有的酶如羧肽酶和氨肽酶則可逐個(gè)水解蛋白肽鏈末端氨基酸殘基，這些酶的共同作用能夠高效催化蛋白質(zhì)水解[19-20]。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，采用木瓜蛋白酶和胰酶雙酶共同酶解玉米黃粉，優(yōu)化酶解工藝，制備具有高醒酒活性的玉米肽，并對(duì)玉米肽中具有醒酒活性的成分分離、富集，以期開發(fā)出安全、高效的玉米醒酒肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃粉，肇慶煥發(fā)生物科技有限公司，粗蛋白含量為61.36%。

木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司；胰酶，廣州華琪生物科技有限公司；乙醇脫氫酶（ADH，375 U/mg），美國(guó)Sigma 公司；ADH 測(cè)定試劑盒，南京建成生物科技有限公司有限公司；乙腈及甲醇等均為色譜純級(jí)，美國(guó)Sigma 公司；無(wú)水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等試劑，國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

VarioskanFLash 型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司；KDH-2C 型定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海雷磁精密儀器廠；Waters600 型高效液相色譜儀，美國(guó) Waters 公司；1290 型超高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；maXis impact 型超高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，德國(guó)Bruker 公司；紫外可見分光光度計(jì)，尤尼科（上海）儀器有限責(zé)任公司；DFY-500 型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；SCIENTZ-12N 型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；H2050 型高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀集團(tuán)；KDN-40 型消化爐，上海新嘉電子有限公司；SHA-C 型水浴搖床，常州澳華儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米肽的制備及醒酒成分的富集工藝流程玉米黃粉→粉碎（過(guò)80 目篩）→加熱處理→調(diào)pH 值→酶解→滅酶→離心取上清→冷凍干燥→玉米肽→80%醇沉→G15→凍干→高醒酒活性玉米肽。

1.3.2 木瓜蛋白酶和胰酶酶解條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 料液比對(duì)玉米黃粉蛋白質(zhì)回收率和ADH激活率的影響 稱取6 份玉米黃粉各10 g，分別按1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶15，1∶18 的料液比加入去離子水，于100 ℃加熱30 min，冷卻，調(diào)節(jié)pH 值至8.0。分別加入原料質(zhì)量1%的木瓜蛋白酶和胰酶，于55 ℃酶解8 h，沸水浴10 min 滅酶，離心取上清，測(cè)定玉米黃粉蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率。

1.3.2.2 酶添加量對(duì)玉米黃粉蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率的影響 稱取5 份玉米黃粉各10 g，分別加入100 mL 的去離子水，于100 ℃加熱30 min，冷卻，調(diào)節(jié)pH 值至8.0，分別加入總酶量為0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%的木瓜蛋白酶和胰酶，木瓜蛋白酶和胰酶添加量比為1∶1，于55 ℃酶解8 h，沸水浴10 min 滅酶，離心取上清，測(cè)定玉米黃粉蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率。

1.3.2.3 酶配比對(duì)玉米黃粉蛋白質(zhì)回收率和ADH激活率的影響 稱取5 份玉米黃粉，分別加入100 mL 的去離子水，于100 ℃加熱30 min，冷卻，調(diào)節(jié)pH 值至8.0，總酶添加量為2%，分別加入酶配比為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3 的木瓜蛋白酶和胰酶，于55 ℃酶解8 h，沸水浴10 min 滅酶，離心取上清，測(cè)定玉米黃粉蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率。

1.3.2.4 酶解時(shí)間對(duì)玉米黃粉蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率的影響 稱取6 份玉米蛋白粉，分別加入100 mL 的去離子水，于100 ℃加熱30 min，冷卻，調(diào)節(jié)pH 值至8.0，分別加入原料質(zhì)量1%的木瓜蛋白酶和胰酶，于55 ℃分別酶解2，4，6，8，10，12 h，沸水浴10 min 滅酶，離心取上清，測(cè)定玉米黃粉蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率。

1.3.3 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)玉米肽醒酒成分的分離富集 稱取3 份玉米肽，按料液比1∶7 分別加入40%，60%，80%的乙醇，于室溫下振蕩30 min，收集上清和沉淀，蒸發(fā)濃縮水洗去除乙醇，測(cè)定ADH 激活率。

1.3.4 葡聚糖凝膠G-15 對(duì)玉米肽具有醒酒活性的成分的分離富集 取上述分離的樣品配成100 mg/mL 的溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，上樣量為1 mL，用去離子水洗脫，流速為1 mL/min。收集分離峰，測(cè)定ADH 激活率。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用凱氏定氮法測(cè)定[19]，計(jì)算蛋白質(zhì)回收率。

蛋白質(zhì)回收率=（酶解液的蛋白質(zhì)含量×上清液質(zhì)量）/（原料的蛋白質(zhì)含量×原料質(zhì)量）×100%

1.3.6 ADH 激活率的測(cè)定 ADH 在有NAD+存在的弱堿性范圍內(nèi)，催化乙醇的脫氫生成乙醛的反應(yīng)如下：

同時(shí)NAD+被還原成NADH（氧化型輔酶I）。NADH 在波長(zhǎng)340 nm 處有一強(qiáng)吸收峰，通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)340 nm 處NADH 吸光度每分鐘的變化值，衡量ADH 的活力。

參考Xiao等[4]方法并稍作修改。將50 μL 質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的玉米肽溶液與150 μL 的工作液（乙醇脫氫酶測(cè)定試劑盒）混合，在37 ℃平衡5 min 后，通過(guò)添加50 μL 的ADH（2 U/mL）引發(fā)反應(yīng)。使用多功能酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)340 nm 處測(cè)定吸光度，每10 s 測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定10 min。使用試劑一（緩沖液）作陰性對(duì)照。繪制擬合反應(yīng)曲線，并計(jì)算0 min 擬合曲線的一階導(dǎo)數(shù)作為NADH 的增加速率，即初始反應(yīng)速率。所有測(cè)定1 式3 份進(jìn)行。ADH 活化率通過(guò)使用以下公式計(jì)算：

ADH 激活率=（Vs-Vo）/Vo×100%

式中，Vo——陰性對(duì)照的初始反應(yīng)速率，AU/s；Vs——是測(cè)試樣品的反應(yīng)速率，AU/s。

1.3.7 分子質(zhì)量分布的測(cè)定 采用高效液相色譜測(cè)定酶解液肽分子質(zhì)量的分布情況。參考李露芳等[21]的方法。色譜條件如下：色譜柱采用TSK gel G200SWXL，流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸水溶液與乙腈按照8∶2 混合，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流速1 mL/min，檢測(cè)時(shí)間20 min，進(jìn)樣體積20 μL。標(biāo)準(zhǔn)肽樣品：牛血清白蛋白（68 000 u）、馬心細(xì)胞色素C（12 384 u）、抑肽酶（6511 u）、Gly-Gly-Gly（189 u），相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值與洗脫體積擬合直線方程為y=-1.7549x+13.842（R2=0.9937），其中，y 為標(biāo)準(zhǔn)肽分子質(zhì)量對(duì)數(shù)，x 為洗脫體積。

1.3.8 UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 鑒定肽結(jié)構(gòu)[22]

將富集到的組分溶于超純水中，使其質(zhì)量濃度為2 mg/mL，進(jìn)樣到在線連接RP-UPLC T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）的電噴霧質(zhì)譜儀。進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相A 為水-甲酸（體積比1 000∶1），流動(dòng)相B 為乙腈，所采用的梯度洗脫流程如下：0～1 min，0% B；1～9 min，0%～30.0% B（線性梯度）；9～10 min，30.0% B（等量洗脫）；10～13 min，30.0%～0% B（線性梯度）；13～15 min，0% B；流速：0.50 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。樣品以100 μL/min 的流速進(jìn)入質(zhì)譜儀，采用正離子掃描模式，霧化氣和干燥氣為高純氮?dú)?，掃描范圍為質(zhì)/核比100～2 000 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜蛋白酶和胰酶酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 料液比對(duì)蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率的影響 在酶解反應(yīng)過(guò)程中，底物濃度是限制反應(yīng)速度的關(guān)鍵因素。底物濃度太低，反應(yīng)速度慢，且不經(jīng)濟(jì)；底物濃度過(guò)高，則部分底物不能溶解，影響傳質(zhì)[23]。由圖1a可知，在木瓜蛋白酶和胰酶共同酶解下，玉米黃粉在不同料液比時(shí)的蛋白質(zhì)回收率在59.14%～72.21%之間。當(dāng)料液比從1∶18 提升到1∶6 時(shí)，底物濃度逐漸增加，蛋白質(zhì)回收率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在料液比為1∶12 時(shí)，達(dá)到最大值72.12%。料液比較低，蛋白質(zhì)底物和酶分子濃度低，不利于酶分子與蛋白質(zhì)分子有效接觸。而隨著料液比的提升，蛋白酶與底物蛋白質(zhì)分子的接觸幾率增加，因此蛋白質(zhì)回收率增加。當(dāng)料液比繼續(xù)提升，溶液較為黏稠，在攪拌狀態(tài)下依然不利于酶催化速度及產(chǎn)物分子的擴(kuò)散，從而對(duì)水解產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)回收率下降[24]。

由圖1b可知，不同料液比時(shí)玉米肽的ADH激活率在52.89%～66.11%。隨著料液比的提升，ADH 激活率呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶10，ADH 激活率達(dá)到最大值66.11%。結(jié)合蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率綜合考慮，選擇1∶10 作為酶解反應(yīng)最佳的料液比。

2.1.2 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率的影響 由圖2a可知，蛋白質(zhì)回收率隨著木瓜蛋白酶和胰酶總加酶量的增加而增大，這是因?yàn)榈鞍酌赣昧吭黾?，使得蛋白酶與蛋白質(zhì)分子的接觸機(jī)率增加，從而使蛋白質(zhì)回收率呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。當(dāng)總加酶量增加到2.5%時(shí)，蛋白質(zhì)回收率達(dá)到70.13%后基本不再變化，這可能是由于酶與底物之間達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)，過(guò)飽和狀態(tài)時(shí)酶之間會(huì)形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，抑制其催化作用[25]。

由圖2b可以看出，玉米肽對(duì)ADH 激活率在50.68%～66.52%。隨著加酶量增加，ADH 激活率增加，當(dāng)加酶量為2.5%，ADH 激活率達(dá)到最大值；當(dāng)加酶量超過(guò)2.5%，ADH 激活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。加酶量為2%與2.5%時(shí)，蛋白質(zhì)回收率相差很小，ADH 激活率沒有顯著性差異。出于經(jīng)濟(jì)成本考慮，選擇2%作為最佳的加酶量。

圖1 料液比對(duì)蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率的影響Fig.1 Effects of liquid-to-material ratio on protein recovery ratio and ADH activation ratio

圖2 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率的影響Fig.2 Effects of quantity of enzyme on protein recovery ratio and ADH activation ratio

2.1.3 酶配比對(duì)蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率的影響 由圖3a可知，在總酶添加量確定的情況下，木瓜蛋白酶和胰酶比例由3∶1 變化到1∶3 時(shí)，蛋白質(zhì)回收率為66.66%～69.29%，變化趨勢(shì)不明顯，故木瓜蛋白酶和胰酶的比例并不是影響蛋白質(zhì)回收率的關(guān)鍵因素。當(dāng)木瓜蛋白酶與胰酶按1∶1 的比例添加時(shí)，蛋白回收率略高。

由圖3b可知，當(dāng)木瓜蛋白酶和胰酶比例由3∶1 變化到1∶1，ADH 激活率呈增大的趨勢(shì)；當(dāng)胰酶與木瓜蛋白酶之間的比例超過(guò)1∶1 時(shí)，ADH 激活率之間無(wú)顯著性差異。綜合蛋白質(zhì)回收率結(jié)果，選擇木瓜蛋白酶與胰酶比為1∶1 作為最佳的酶配比。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率的影響 由圖4a可知，在木瓜蛋白酶和胰酶共同酶解條件下，當(dāng)酶解時(shí)間由2 h 增加到8 h，蛋白質(zhì)回收率呈增加的趨勢(shì)，由52.64%增加到70.60%。當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)8 h，蛋白質(zhì)回收率的增加趨勢(shì)趨于平緩，最終蛋白質(zhì)回收率為72.35%?？赡芤?yàn)樵诿附獬跗冢孜锏鞍踪|(zhì)量比較大，酶活性高，產(chǎn)物少等有利因素使大量底物蛋白質(zhì)被迅速水解為小分子肽，使得蛋白質(zhì)回收率增加；酶解進(jìn)行一段時(shí)間后，蛋白質(zhì)回收率的上升趨勢(shì)變緩，這是因?yàn)榈孜锏鞍踪|(zhì)含量逐步下降，產(chǎn)物逐漸增多，由于反饋抑制致使水解速度下降，從而使蛋白質(zhì)回收率增加趨勢(shì)變緩[26]。

由圖4b可知，當(dāng)酶解時(shí)間由2 h 增加到10 h，ADH 激活率由55.09%增加到65.28%，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到12 h，ADH 激活率下降到61.54%。酶解時(shí)間8 h 和10 h 的蛋白質(zhì)回收率相差不大，ADH激活率無(wú)顯著性差異。出于經(jīng)濟(jì)成本考慮，選擇8 h 作為最佳酶解時(shí)間。

圖3 酶配比對(duì)蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率的影響Fig.3 Effects of enzyme ratio on protein recovery ratio and ADH activation ratio

圖4 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)回收率和ADH 激活率的影響Fig.4 Effects of hydrolysis time on protein recovery ratio and ADH activation ratio

2.2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分離富集的玉米肽對(duì)ADH 激活率的影響

由圖5可知，采用40%，60%，80%乙醇分離富集玉米肽的上清液中ADH 的激活率依次為62.85%，56.74%，40.13%，呈下降趨勢(shì)。原玉米肽的ADH 激活率為64.89%，高于不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分離的上清液的ADH 激活率。不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分離的沉淀中的ADH 的激活率依次為31.83%，36.45%，76.24%，呈上升趨勢(shì)，其中80%乙醇分離的玉米肽沉淀的ADH 激活率達(dá)76.24%，顯著高于原玉米肽，說(shuō)明80%乙醇可以使具有高ADH 激活活性的玉米肽得到有效富集。

2.3 葡聚糖凝膠G-15 凝膠柱對(duì)玉米肽中醒酒成分的分離富集

由圖6a可知，80%醇沉的玉米肽經(jīng)過(guò)凝膠柱分離，得到4 個(gè)峰。由圖6b可知，G1 和G2 組分的ADH 的激活率小于醇沉組分的ADH 激活率，而G3 和G4 的ADH 激活率大于醇沉組分的ADH激活率，其中G3 組分的激活率為78.36%，G4 組分的ADH 激活率為90.12%，與醇沉組分相比差異顯著。說(shuō)明用葡聚糖凝膠G-15 凝膠柱分離可使具有ADH 激活的玉米肽進(jìn)一步得到富集。

圖5 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分離得到的玉米肽對(duì)ADH 激活的影響Fig.5 Effects of corn peptides isolated from different concentrations of ethanol on ADH activation ratio

由表1可知，葡聚糖凝膠G-15 凝膠柱分離的4 個(gè)組分分子質(zhì)量大小不同，其中G1 和G2 中分子質(zhì)量在1～3 ku 范圍內(nèi)的組分占主要部分，G3和G4 中分子質(zhì)量<0.5 ku 的組分占主要部分，分別為72.76%和87.27%。G3 和G4 小于1 ku 的組分各占80.01%，91.02%，隨著洗脫時(shí)間的推移，后面的峰中小分子質(zhì)量組分所占的比例越來(lái)越大，這是因?yàn)槟z色譜是依據(jù)溶質(zhì)分子體積大小的差別，按照分子尺寸由大到小的順序出峰，大的分子不能進(jìn)入填料顆粒的內(nèi)徑，只能隨流動(dòng)相從填料顆粒的縫隙中直接流出柱子，所以先出峰，而小的分子可進(jìn)入填料顆粒的內(nèi)部，走的路徑長(zhǎng)，所以后出峰[27]。很多研究都發(fā)現(xiàn)小分子量的肽段具有更高的生物活性，并且更利于人體吸收[28-29]。

圖6 玉米肽的葡聚糖凝膠G-15 凝膠柱分離及ADH 激活率測(cè)定Fig.6 Sephadex G-15 separation of corn peptide s and deter mination of ADH activation ratio

表1 葡聚糖凝膠G-15 凝膠柱分離組分的分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular weight distribution of separation components of sephadex G-15

表2 為葡聚糖凝膠G-15 凝膠柱分離的4 個(gè)組分的得率，其中G2 組分得率最大為47.79%，G3組分得率最小僅有3.25%，G4 組分得率為9.12%，4 個(gè)組分的得率與葡聚糖凝膠G-15 凝膠色譜圖相對(duì)應(yīng)。

2.4 玉米醒酒肽的結(jié)構(gòu)鑒定

將G4 組分通過(guò)UPLI-MS/MS 進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。圖7 和圖8是G4 組分的基峰圖（Base peak chromatogram，BPC）譜圖及在波長(zhǎng)220 nm 處的UV 譜圖。G4 組分的UV 譜圖在1.08 min 和4.26 min 處各有1 個(gè)主峰，而其它峰信號(hào)較微弱，經(jīng)后續(xù)質(zhì)譜鑒定這2 個(gè)峰分別為Tyr 及Trp。由于這2種氨基酸含有苯環(huán)，在紫外區(qū)有很強(qiáng)的吸收，從而會(huì)對(duì)其它在紫外區(qū)響應(yīng)較弱的物質(zhì)產(chǎn)生掩蔽效應(yīng)。

表2 葡聚糖凝膠G-15 凝膠柱分離組分的得率Table 2 Yield distribution of separation components of sephadex G-15

圖7 G4 組分的BPC 譜圖Fig.7 Base peak chromatogram（BPC）of G4

圖8 G4 組分在220 nm 處的紫外色譜圖Fig.8 UV chromatogram at 220 nm of G4

搜索MASCOT 數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到6 條肽段，分別是 GQAIILP，GGTALPA，QAKGILP，YQQPIIGGA，VAAGGPA，VAVGGVP，上述肽段富含疏水性氨基酸（Ala，Leu，Ile，Pro，Tyr，Val），疏水性氨基酸所占比例為55.56%～71.43%。玉米肽中因富含疏水性氨基酸而表現(xiàn)出很好的抗氧化性，對(duì)乙醇代謝產(chǎn)生的大量氧自由基具有平衡作用[30]。此外，Yamaguchi[16]證明Leu 和Ala 有利于醒酒，它們通過(guò)穩(wěn)定乙醇代謝所需的NAD+而加速酒精代謝。本文所鑒定的6 條肽都含有Ala，3 條肽含有Leu，所以這6 條肽段具有潛在的醒酒活性。王真真[31]也在玉米蛋白水解物中鑒定出相同的肽段Y-Q-QP-I-I-G-G-A。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了最優(yōu)酶解條件為：料液比1∶10、加酶量2%，木瓜蛋白酶和胰酶添加量比1∶1、酶解時(shí)間8 h，在此酶解條件下，蛋白質(zhì)回收率為69.89%，ADH 激活率為65.72%。說(shuō)明該方法能夠用于制備具有醒酒活性的玉米肽。通過(guò)乙醇分離方法和凝膠柱層析法對(duì)玉米肽中具有醒酒活性的成分進(jìn)行分離富集，得到具有高ADH 激活活性的G4 組分，其ADH 激活率達(dá)90.12%，較原酶解液提高24.4%。進(jìn)一步將G4 組分通過(guò)UPLC-MS/MS 進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，然后通過(guò)搜索UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中的玉米蛋白庫(kù)，得到6 條多肽。這6 條多肽具有潛在的醒酒活性，而這些肽段對(duì)ADH 的作用機(jī)理及構(gòu)效關(guān)系還需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)以玉米加工過(guò)程中的副產(chǎn)物玉米黃粉為原料，通過(guò)生物可控酶解技術(shù)制備具有醒酒活性玉米肽，反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、全程可控和副產(chǎn)物少，不僅可以提高玉米蛋白高值化深加工利用，為保護(hù)環(huán)境做貢獻(xiàn)，還能逐漸的滿足人們對(duì)解酒產(chǎn)品的需求，使其在保健食品、藥品上具有廣泛應(yīng)用的前景。