潘 聰 張大力* 段盛林 苑 鵬 夏 凱 李占東于偉厚 劉美宏 于寒松 趙可心

（1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長(zhǎng)春130118 2 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京100015 3 吉林工程技術(shù)師范學(xué)院食品工程學(xué)院 長(zhǎng)春130052 4 大連雙迪科技股份有限公司 遼寧大連116635）

酵母水解物（Yeast hydrolyzate，YH）也稱復(fù)合酵母，是利用內(nèi)源酶（細(xì)胞內(nèi)自溶酶）及外源酶水解釋放核酸和小肽等功效成分而獲得的純培養(yǎng)酵母自溶物。高核苷酸酵母水解物（High nucleotide yeast hydrolyzate，HNYH）富含大量核酸、核苷酸（AMP，CMP，GMP，UMP，IMP）、小肽、消化酶、游離氨基酸、B 族維生素及酵母細(xì)胞壁。核苷酸具有多種生物學(xué)活性[1-2]，在能量代謝及蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中起著重要的作用[3]。據(jù)報(bào)道，酵母核苷酸具有抗氧化，增強(qiáng)機(jī)體免疫力及維持機(jī)體胃腸道功能等作用。核苷酸作為核酸的組成單位，幾乎參與體內(nèi)所有代謝過(guò)程，是體內(nèi)許多酶和輔酶的重要組成成分，在細(xì)胞物質(zhì)與能量代謝以及功能調(diào)節(jié)中起重要作用[4]。近年來(lái)的研究表明，酵母核苷酸具有提高免疫力，促生長(zhǎng)，抗氧化，促進(jìn)機(jī)體損傷修復(fù)，降低細(xì)胞凋亡以及抗炎等功能[5-8]。Ames等[9]認(rèn)為核酸及相關(guān)物質(zhì)均可作為內(nèi)源性自由基清除劑和抗氧化劑，具有與VC類似的作用。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡的一種狀態(tài)。氧化應(yīng)激損傷會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）和自由基，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)生成丙二醛（Malonicdialdehyde，MDA）。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，促進(jìn)胞內(nèi)乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）向胞外釋放。此外，氧化應(yīng)激會(huì)引發(fā)自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，降低超氧化物歧化酶（Super oxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10-12]。

目前，關(guān)于高核苷酸酵母水解物的體外抗氧化作用及其機(jī)制尚無(wú)深入研究，相關(guān)核苷酸抗氧化能力多基于體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。本研究分析了高核苷酸酵母水解物在體外條件下清除活性氧的能力及其對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高核苷酸酵母水解物（經(jīng)測(cè)定高核苷酸酵母水解物中蛋白質(zhì)含量61.95%，氯化鈉0.2%，總核苷酸含量13.56%。其中0.049% AMP，2.17%CMP，3.39% GMP，3.54% UMP，4.42% IMP），大連珍奧生物技術(shù)有限公司提供；AMP，CMP，GMP，UMP，IMP 5種核苷酸標(biāo)品，北京華威思科科技有限公司；肝癌細(xì)胞株（HepG2），中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院保存；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）、平衡鹽緩沖液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）、DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基、小牛血清，美國(guó)Gibco 公司；油酸（Oleic acid，OA）、棕櫚酸（Palmitic acid，PA）、DCFH-DA、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑蘭（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenylterazolium bromide，MTT）、胰蛋白酶，美國(guó)Sigma 化學(xué)公司；無(wú)FFA 牛血清蛋白（FFA-free bovine serum albumin，BSA），日本W(wǎng)AKO 公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、氧自由基（ROS）試劑盒，南京建成生物工程研究所；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、山羊抗鼠IgG/HRP 二抗、山羊抗兔IgG/HRP 二抗，碧云天生物有限公司；鼠抗β-actin 單克隆抗體、兔抗Nrf2 單克隆抗體、兔抗PARP 單克隆抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；TransZol Up RNA 提取試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；所有有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，島津（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；低溫高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；倒置生物顯微鏡，日本OLympus 公司；生物安全柜，中國(guó)濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；37 ℃CO2培養(yǎng)箱MCO-20AIC，松下健康醫(yī)療器械（上海）有限公司；酶標(biāo)儀Spectra Max i3，美國(guó)MD 公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ-250DE 超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DK-8D三溫三控水槽，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，伯樂有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取高核苷酸酵母水解物溶于超純水中，離心（4 000 r/min，10 min）取上清待用。

1.3.1 DPPH 自由基清除作用檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[13]的方法，準(zhǔn)確稱取0.0079 g DPPH 用無(wú)水乙醇溶解，定容至100 mL，配制成濃度為2×10-4mol/L的DPPH 溶液。精確取1 mL 不同濃度的待測(cè)液于5 mL 離心管中，加入1 mL DPPH 溶液和0.5 mL 75%的乙醇，使體系總體積為2.5 mL。避光反應(yīng)30 min，3 000 r/min 離心取上清。采用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)吸光值，以吸光值的下降表示其對(duì)自由基的消除能力。DPPH 自由基清除率根據(jù)式（1）計(jì)算：

式中，A0——加DPPH（1 mL DPPH+1 mL 水+0.5 mL 75%乙醇）的吸光度；A1——樣品與DPPH反應(yīng)后的吸光度（1 mL DPPH+1 mL 待測(cè)液+0.5 mL 75%乙醇）；A2——樣品的空白對(duì)照（1 mL 75%乙醇+1 mL 待測(cè)液+0.5 mL 75%乙醇）的吸光度；A空白——DPPH 空白對(duì)照（1 mL 75%乙醇+1 mL 水+0.5 mL 75%乙醇）的吸光度。

1.3.2 羥自由基清除檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[14]的方法，取若干10 mL 離心管，依次加入0.6 mL 的FeSO4（8.0 mmol/L），0.5 mL 的H2O2（0.02 mmol/L），2 mL的水楊酸（3 mmol/L）及2 mL 不同梯度稀釋的樣品。37 ℃保溫30 min 后，加入0.9 mL 的HCl（1 mol/L）終止反應(yīng)，反應(yīng)體系終體積為6.0 mL，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10 min，取上清測(cè)定波長(zhǎng)510 nm處的吸光度值，以多酚提取物抑制羥自由基引發(fā)的水楊酸羥基化作用的程度表示其羥自由基的清除能力。樣品清除率根據(jù)式（2）計(jì)算：

式中，A0——空白組吸光度；A1——樣品的吸光度；A2——樣品空白對(duì)照的吸光度。

1.3.3 總還原力的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[15]的方法，配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）30.0 mg，加入10 mL 無(wú)水甲醇溶解，轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，質(zhì)量濃度為300 μg/mL。分別加入pH 6.6 的PBS 緩沖液1.0 mL、1%鐵氰化鉀溶液1.0 mL、不同質(zhì)量濃度待測(cè)液1.0 mL 于試管中，搖勻后置于50 ℃水浴鍋中加熱20 min，待冷卻后加入1%三氯乙酸2.5 mL 并搖勻，離心（3 000 r/min，10 min），吸取2.0 mL 于另一只試管中，加入蒸餾水5.0 mL 和0.1%三氯化鐵1.0 mL，混勻后靜置10 min，于波長(zhǎng)700 nm 處測(cè)定反應(yīng)體系的OD 值，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次后求得平均值，繪制總還原能力變化曲線。

1.4 HepG2 抗氧化模型

1.4.1 HepG2 的培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[16]的方法，人肝癌細(xì)胞株HepG2 培養(yǎng)于含10%新生牛血清，青霉素100 U/mL 和鏈霉素100 μg/mL 的DMEM 培養(yǎng)基中（下文簡(jiǎn)稱DMEM10），在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以3.5×106個(gè)/mL 濃度接種于96 孔板中，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿時(shí)，用PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞一次，加入不同的處理液，試驗(yàn)分組如下：對(duì)照組（DMEM10）、模型組（FFA 200 μg/mL）以及不同質(zhì)量濃度高核苷酸酵母水解物的試驗(yàn)組（試驗(yàn)組1 質(zhì)量濃度300 μg/mL、試驗(yàn)組2質(zhì)量濃度500 μg/mL、試驗(yàn)組3 質(zhì)量濃度1 000 μg/mL）。

1.4.2 MTT 法測(cè)定HepG2 細(xì)胞存活率 取96 孔培養(yǎng)板，每孔加100 μL 細(xì)胞懸液，HepG2 細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)液，用PBS 清洗一次，試驗(yàn)組加入不同質(zhì)量濃度的高核苷酸酵母水解物干預(yù)處理24 h 后除去培養(yǎng)液。加入0.5 mg/mL MTT-DMEM，于37 ℃避光孵育4 h，加入100 μL DMSO，振蕩以便完全溶解MTT 紫色結(jié)晶產(chǎn)物。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定吸光度值。以對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞存活率為100%計(jì)算其余組別細(xì)胞存活率。

1.5 氧化指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 ROS 的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2 細(xì)胞，將對(duì)照組、模型組、試驗(yàn)組分別進(jìn)行相應(yīng)處理。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入2 mL 的熒光探針DCFH-DA（10 μmol/L），于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次后，收集細(xì)胞，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，結(jié)果以模型組ROS 含量的百分比表示。

1.5.2 氧化損傷標(biāo)志物測(cè)定 按1.4.1 節(jié)的不同分組處理細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)束離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌3 次，加入細(xì)胞裂解液裂解3～5 s，離心（2 500 r/min，10 min）并收集細(xì)胞上清液。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液蛋白質(zhì)含量，MDA 含量按試劑盒方法測(cè)定，結(jié)果以mmol/mg 表示。

1.5.3 SOD 和GSH-Px 活力測(cè)定 按1.4.1 節(jié)的不同分組處理細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)束離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌3 次，加入細(xì)胞裂解液，冰浴條件下裂解3～5 s，離心（2 500 r/min，10 min）并收集細(xì)胞上清液。BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液蛋白濃度，SOD 和GSH-Px 酶活按檢測(cè)試劑盒方法測(cè)定，酶活力以U/mg 表示。

1.6 高核苷酸酵母水解物對(duì)FFA 刺激HepG2細(xì)胞keap1，Nrf2，HO-1 和NQO-1 mRNA 表達(dá)水平的影響

RT-PCR 檢測(cè)keap1，Nrf2，HO-1 和NQO-1的mRNA 表達(dá)水平。收集各組肝癌細(xì)胞，按照全式金試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，用RNA/DNA 超微量測(cè)定儀對(duì)RNA 進(jìn)行定量分析，測(cè)定RNA 純度及濃度。PCR 反應(yīng)條件為：45 ℃，5 min；94 ℃，30 s；94 ℃，5 s；60 ℃，1 min；循環(huán)40 次。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，使用Bio-Rad 公司圖像分析儀成像并進(jìn)行半定量分析，引物序列如表1所示。

1.7 免疫印跡檢測(cè)Nrf2 蛋白的表達(dá)水平

采用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒于冰上分離各組樣品細(xì)胞中的核蛋白和漿蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。采用免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)Nrf2 蛋白的表達(dá)水平，保持凝膠電泳每孔蛋白質(zhì)上樣量達(dá)30 μg，利用10% SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂奶粉封閉2 h。將膜置于按體積比1∶1 000 配制的一抗稀釋液中4 ℃過(guò)夜，加入TBST 洗膜3 次，將膜浸入按體積比1∶1 000 配制的二抗稀釋液中，室溫條件下?lián)u床孵育1 h，加入TBST 洗膜3 次。加入ECL 顯色液，曝光顯色，利用Image J 軟件分析灰度值。

表1 試驗(yàn)用各目標(biāo)基因特異性引物序列Tab1e 1 Sequences of primers for target genes of amplified fragment

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 HNYH 體外抗氧化指標(biāo)

DPPH是自由基清除活性試驗(yàn)中的一個(gè)重要的化學(xué)試劑，OH·被認(rèn)為是最能體現(xiàn)活細(xì)胞中抗氧化活性的指標(biāo)，它可以參與所有活細(xì)胞和生物大分子的代謝反應(yīng)[17]?？寡趸瘎┠芡ㄟ^(guò)自身的還原作用，通過(guò)給出電子清除自由基，其還原能力越強(qiáng)表明其抗氧化能力越強(qiáng)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.9596x-0.007，R2=0.9945，將總還原力OD 值換算成有效成分蘆丁質(zhì)量濃度，結(jié)果如表2所示，隨著高核苷酸酵母水解物質(zhì)量濃度增大，DPPH 清除率、羥自由基清除率、總還原能力逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明高核苷酸酵母水解物的抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。

表2 不同質(zhì)量濃度高核苷酸酵母水解物的DPPH，OH- 清除率和總還原力Table 2 Different mass concentration of high-dose yeast hydrolysates DPPH，OH- clearance and total reducing power

2.2 HNYH 對(duì)HepG2 細(xì)胞活力的影響

由表3可知，各質(zhì)量濃度組的細(xì)胞存活率都在95%以上，說(shuō)明高核苷酸酵母水解物在100～1 000 μg/mL 范圍內(nèi)對(duì)HepG2 細(xì)胞均無(wú)明顯的毒性作用。

表3 不同質(zhì)量濃度高核苷酸酵母水解物對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響Table 3 Effects of different mass concentration of high-dose yeast hydrolysates on the viability of HepG2 cells

2.3 HNYH 對(duì)FFA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)氧化指標(biāo)的影響

2.3.1 ROS 的含量 細(xì)胞內(nèi)過(guò)量ROS 的產(chǎn)生會(huì)使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。因此，細(xì)胞內(nèi)ROS 含量可以直接反應(yīng)映細(xì)胞氧化損傷的程度[18]。采用熒光探針DCFH-DA法，測(cè)定各組HepG2 細(xì)胞中ROS 含量，結(jié)果如圖1所示。試驗(yàn)組和對(duì)照組ROS 含量均顯著低于模型組（P<0.05）。FFA 能通過(guò)誘發(fā)大量ROS 的生成對(duì)HepG2 細(xì)胞造成損傷，而高核苷酸酵母水解物則通過(guò)降低細(xì)胞中ROS 的含量對(duì)HepG2 細(xì)胞起到保護(hù)作用。

2.3.2 MDA 的含量 MDA是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的氧化損傷標(biāo)志物，其含量間接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平。MDA可由細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與ROS 發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)生成，能破壞甚至摧毀細(xì)胞膜[19]。MDA 能和硫代巴比妥酸反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，利用這一性質(zhì)可測(cè)定HepG2 細(xì)胞內(nèi)的MDA 含量。由圖2可知，模型組的MDA 含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），這與FFA 能誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS 密切相關(guān)；而試驗(yàn)組隨著高核苷酸酵母水解物質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)FA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)的MDA 含量逐漸減少，這一結(jié)果與2.3.1 節(jié)ROS 含量測(cè)定的結(jié)果相符，說(shuō)明高核苷酸酵母水解物能夠緩解FFA 對(duì)HepG2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的氧化損傷。

圖1 HNYH 對(duì)FAA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的影響Fig.1 Effects of HNYH on ROS production in FAA-induced HepG2 cells

圖2 HNYH 對(duì)FAA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的影響Fig.2 Effects of HNYH on the content of MDA in FAA-induced HepG2 cells

2.4 高核苷酸酵母水解物對(duì)FFA 誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響

2.4.1 SOD 活力 SOD是一種金屬酶，是機(jī)體內(nèi)抵抗ROS 損傷的第一道防御關(guān)卡，可以使有毒的超氧化自由基降解為氧和過(guò)氧化物[20]。由圖3可知，除試驗(yàn)組1 外其余組SOD 的酶活力均顯著大于模型組（P<0.05）。說(shuō)明高核苷酸酵母水解物能通過(guò)提高胞內(nèi)SOD 的酶活力保護(hù)HepG2 細(xì)胞抵抗FFA 誘導(dǎo)的損傷作用，并且與高核苷酸酵母水解物的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，高核苷酸酵母水解物的這一功能可能與細(xì)胞內(nèi)的一種核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2相關(guān)[21]。

2.4.2 GSH-PX 酶活力 GSH-Px是機(jī)體存在的一種清除自由基和抑制自由基反應(yīng)的酶系統(tǒng)，其活力水平也是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。GSH-Px 在體內(nèi)能通過(guò)GSH 調(diào)控ROS 生成并清除有機(jī)過(guò)氧化物[22]。GSH是一種內(nèi)源性巰基化合物，對(duì)維持細(xì)胞氧化還原平衡和氨基酸平衡，調(diào)控細(xì)胞基因及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用，并且GSH還與多種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和穩(wěn)定性有關(guān)[23]。由圖4～5可知，試驗(yàn)組2 和3 的GSH-Px 酶活力顯著高于模型組（P<0.05），并呈質(zhì)量濃度依賴性趨勢(shì)，說(shuō)明高核苷酸酵母水解物能通過(guò)提高胞內(nèi)GSH-Px 的酶活力和細(xì)胞上清GSH-Px 的酶活力保護(hù)HepG2 細(xì)胞抵抗FFA 誘導(dǎo)的損傷作用，并且與高核苷酸酵母水解物的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，與SOD 酶活力的變化趨勢(shì)一致。

圖3 HNYH 對(duì)FFA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)SOD 酶活力的影響Fig.3 Effects of HNYH on enzyme activities of SOD in FFA-induced HepG2 cells

圖4 HNYH 對(duì)FFA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞內(nèi)GSH-Px 酶活力的影響Fig.4 Effects of HNYH on enzyme activities of GSH-Px in FFA-induced HepG2 cells

2.5 HNYN 對(duì)FFA 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞keap1，Nrf2，HO-1 和NQO-1 mRNA 表達(dá)的影響

圖5 HNYH 對(duì)FFA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞上清GSH-Px 酶活力的影響Fig.5 Effects of HNYH on enzyme activities of GSH-Px in FFA-induced HepG2 cells supernatant

圖6 HNYH 對(duì)FFA 刺激的HepG2 細(xì)胞keap1，Nrf2，HO-1 和NQO-1 mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of mRNA expression levels of keap1，Nrf2，HO-1 and NQO-1 after the intervention of HNYH on HepG2 cells stimulated by FFA

Keap1-Nrf2/ARE 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡，調(diào)控體內(nèi)抗氧化防御機(jī)制的重要途徑[24]。該信號(hào)通路可以通過(guò)編碼HO-1內(nèi)源性保護(hù)基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)HepG2 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[25-26]。Nrf2是調(diào)節(jié)ARE 驅(qū)動(dòng)的II 期基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子，HO-1，NQO-1 和keap1等抗氧化基因的表達(dá)均有Nrf2 參與。正常生理情況下，Nrf2 位于胞漿中并與Keap1 結(jié)合形成復(fù)合體。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)，Nrf2 與Keap1 解離，Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核與ARE 結(jié)合，激活抗氧化酶（HO-1，SOD，GSH-Px）以及Ⅱ相解毒酶的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用，恢復(fù)細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[27-28]。如圖6所示，與正常組相比，模型組的Nrf2，HO-1 和NQO-1 的mRNA 表達(dá)水平均顯著降低，試驗(yàn)組質(zhì)量濃度依賴性地增高Nrf2，HO-1和NQO-1 的mRNA 表達(dá)水平，而keap1 的mRNA表達(dá)水平隨HNYH 質(zhì)量濃度增大逐漸降低。

2.6 HNYN 干預(yù)對(duì)Nrf2 活化與轉(zhuǎn)位的影響

Nrf2是細(xì)胞降低活性氧，抵御外來(lái)有害刺激的重要轉(zhuǎn)錄因子。正常生理情況下，Nrf2 與胞漿中的抑制因子Keap1 結(jié)合，處于無(wú)活性狀態(tài)，并經(jīng)泛素化快速降解。在誘導(dǎo)Nrf2 激活后，Nrf2 與Keap1分離，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中，識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（ARE），啟動(dòng)下游基因表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞抗損傷能力，從而有效抵抗有害物質(zhì)的攻擊。Nrf2 調(diào)控的下游基因主要為Ⅱ相解毒酶基因、抗氧化基因和應(yīng)激基因等，其編碼的蛋白質(zhì)與自由基和外源性化學(xué)物質(zhì)等的代謝、清除以及恢復(fù)并維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[29-30]。由圖7可知，高核苷酸酵母水解物能夠以質(zhì)量濃度依賴性的方式增加HepG2 細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)含量，降低胞漿蛋白質(zhì)含量，進(jìn)一步闡明了高核苷酸酵母水解物對(duì)FFA 誘導(dǎo)的HepG2 氧化損傷的保護(hù)機(jī)制。

圖7 HNYH 對(duì)FFA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞中Nrf2 活化與轉(zhuǎn)位的影響Fig.7 Effects of HNYH on activation and translocation of Nrf2 in HepG2 cells induced by FFA

3 結(jié)論

結(jié)果表明，HNYN 具有較高的體外抗氧化活性，并能以質(zhì)量濃度依賴性的方式清除DPPH 和羥自由基，提高總還原力。MTT 試驗(yàn)結(jié)果顯示100～1 000 μg/L 的HNYN 對(duì)HepG2 細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響。建立游離脂肪酸誘導(dǎo)HepG2 氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)HNYN 通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平，改善抗氧化物酶SOD 和GSH-Px 的活性，緩解細(xì)胞內(nèi)氧化損傷，并且與HNYN 質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。RT-PCR 試驗(yàn)結(jié)果顯示，HNYN 能顯著提高Nrf2、HO-1 和NQO-1 的mRNA 表達(dá)水平，并隨著質(zhì)量濃度增大降低keap1 的mRNA 表達(dá)水平。免疫印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高核苷酸酵母水解物能夠顯著增加HepG2 細(xì)胞核內(nèi)Nrf2 的蛋白質(zhì)含量，降低胞漿內(nèi)Nrf2 蛋白質(zhì)含量，表明HNYN 對(duì)FFA誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用與增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化酶活性、降低自由基水平相關(guān)。進(jìn)一步表明HNYN可通過(guò)調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2 信號(hào)通路，發(fā)揮其對(duì)FFA 誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果表明HNYN 具有顯著的體外抗氧化活性，并且能夠通過(guò)激活Nrf2 通路減輕FFA誘導(dǎo)的HepG2 氧化應(yīng)激損傷，為HNYN 作為一種抗氧化食品原料成分提供了理論依據(jù)。然而，本試驗(yàn)只評(píng)價(jià)了高核苷酸酵母水解物的體外抗氧化活性，酵母核苷酸單一成分的功能性仍需要更深入的研究。