張 寧 龔本義 劉冬禹 楊丹丹 殷玉和 吳叢梅

（長春工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130012）

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種傳染病，一旦發(fā)病100%死亡[1]。狂犬病病毒屬于彈狀病毒科，是一種廣泛傳播的人畜共患疾病[2]。目前，狂犬病除了臨床和實驗室評估外，狂犬病的預(yù)防和控制還取決于快速、具體的診斷技術(shù)[3]。本試驗根據(jù)需要設(shè)計了3種不同濃縮純化方法，建立了PEG沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化、Zn（AC）2沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化、Zn（AC）2沉淀濃縮及Sepharose 4 Fast Flow分離純化制備狂犬病病毒抗原，為狂犬病抗體熒光微球檢測試紙奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 抗原、血清及細(xì)胞

狂犬病病毒CVS-11株病毒液由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司提供；

狂犬病陽性血清由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所惠贈；

陰性血清由長春西諾生物科技有限公司提供；

BHK-21細(xì)胞引自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試劑

PEG 6000、Zn（AC）2、蔗糖等購自北京化工廠以及Ameresco公司；Sepharose 4 Fast Flow 凝膠購自GE Healthcare公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗犬IgG 購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司。

2 方法

2.1 狂犬病滅活病毒液制備

狂犬病病毒CVS-11株病毒液，滅活后制成病毒液[4]，檢驗合格后，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 抗原濃縮純化工藝的研究

將病毒液，4℃、3000r/min離心30min，取上清備用。

2.2.1 PEG沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化 上清液加入NaCl使終濃度為0.5mol/L，加等量10% PEG 6000，4℃過夜，8000r/min離心30min，沉淀加入PBS后為濃縮病毒。取濃縮液以蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化（梯度依次為20%、30%、40%、55%），可見40～55%間有白色條帶，用試劑盒進(jìn)行檢測確定此條帶為純化狂犬病病毒。

2.2.2 Zn（AC）2沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化 上清液加入Zn（AC）2，靜置30min，10000r/min 4℃離心30min，沉淀以飽和EDTA 懸浮，4℃溶解至溶液透明，3000r/min 4℃離心30min，上清即為病毒濃縮液。取其以蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化，可見40～55%間有白色條帶，用試劑盒進(jìn)行檢測確定此條帶為純化狂犬病病毒。

2.2.3 Zn（AC）2沉淀濃縮及Sepharose 4 Fast Flow純化上清液加入Zn（AC）2，靜置30min，10000r/min 4℃離心30min，沉淀以飽和EDTA懸浮，4℃溶解至溶液透明，3000r/min 4℃離心30min，上清即為病毒濃縮液。用 Sepharose 4 Fast Flow對濃縮病毒液進(jìn)行純化[4]。

2.3 純化病毒檢驗

（1）蛋白濃度檢驗 BCA法測定蛋白含量。

（2）蛋白純度檢驗 進(jìn)行SDS-PAGE，分析蛋白純度。

（3）Western-blotting。

（4）活性檢驗。

3 結(jié)果

3.1 濃縮純化抗原濃度和純度檢驗

純化抗原總量和純度PEG沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化法均低于后兩種方法，Zn（AC）2沉淀濃縮后蔗糖密度梯度離心純化抗原與Sepharose 4 Fast Flow純化后收獲蛋白總量和純度見表1，純化SDS-PAGE和Western-blotting 見圖1、圖2。

表1 3種方法純化抗原檢測結(jié)果

圖1 Zn（AC）2沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化抗原SDS-PAGE圖譜

圖2 Zn（AC）2沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化抗原Westernblotting圖譜

3.2 濃縮純化抗原活性檢測

PEG沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化抗原制備的檢測試紙條熒光強度弱于后兩種方法，Zn（AC）2沉淀濃縮及蔗糖密度梯度離心純化抗原與Zn（AC）2沉淀濃縮及Sepharose 4 Fast Flow純化抗原制備的檢測試紙條熒光強度無明顯差異，見表2。

表2 不同病毒抗原制備試紙條熒光強度

4 結(jié)論

通過上述3種純化方法制備狂犬病病毒抗原蛋白進(jìn)行病毒含量、純度及與活性檢驗，考慮成本及工藝，選擇Zn（AC）2沉淀法濃縮及蔗糖密度梯度離心純化法制備狂犬病病毒抗原。此方法制備的狂犬病病毒純化抗原用熒光微球標(biāo)記后可有效結(jié)合兔抗狂犬病病毒IgG。