王小冬，楊木清，劉 斌，鄧現語，劉 穎，音洋洋，李濟宇

肥大細胞來源于骨髓的造血干細胞，主要分布于皮膚、呼吸道和消化道的結締組織中，其不僅參與機體的炎癥反應，還能調節(jié)血管生成和神經傳導[1-2]。臨床研究發(fā)現肥大細胞在腫瘤組織中的浸潤量與疾病的預后密切相關[3-4]。

外泌體是細胞通過內體途徑分泌到胞外的納米級囊泡[5]。研究[6-7]表明外泌體能夠在細胞間轉移其內容物，包括RNA，蛋白質和脂質等。最新研究[8]發(fā)現肥大細胞除了分泌組胺、肝素和細胞因子外還釋放其他生物活性物質-外泌體。然而，關于骨髓源肥大細胞外泌體的提取與鑒定尚未有報道。此外，骨髓源肥大細胞外泌體是否參與調控肝癌的生長尚不清楚，因此，該研究旨在探討骨髓源肥大細胞外泌體對肝癌Hepa1-6細胞增殖、遷移和侵襲的影響，為進一步探索其在肝癌的發(fā)生發(fā)展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1.1實驗細胞與動物 小鼠肝癌細胞(Hepa1-6)購自上海中科院細胞庫；C57/BL6小鼠，雄性8只，體質量(20±2) g，購自上海斯萊克生物有限公司。

1.1.2實驗試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；去外泌體胎牛血清(24 000 r/min，18 h)；小鼠重組白細胞介素( interleukin，IL)-3，干細胞因子(stem cell factor, SCF)(美國Peprotech公司)；PE-CD117、FITC-FcεRIα(美國eBioscience公司)；雙抗(青霉素和鏈霉素)和Edu試劑盒(上海碧云天生物公司)；PKH67染料(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒和甲苯胺藍(上海翊圣生物公司)；兔抗Alix 、兔抗TSG101、兔抗CD63 、兔抗Calnexin、鼠抗Tryptase (美國Abcam公司)；ECL化學發(fā)光顯影液 (美國Millipore公司)；Transwell 小室(美國Costar公司)；低溫高速冷凍離心機 、免疫熒光顯微鏡 (美國Thermo公司)；超速離心機、SW40水平轉頭 (美國Beckman公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1骨髓源肥大細胞的分離與培養(yǎng) 剪取C57/BL6小鼠的股骨，去除股骨上的肌肉組織，并將骨骺端剪斷。用注射器吸取1640培養(yǎng)基，將小鼠骨髓沖出并收集細胞懸液，加入到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶內含RPMI1640、10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素各100 U/ml、10 ng/ml IL-3和10 ng/ml SCF，平均6 d換1次液，5周左右分化成熟。

1.2.2骨髓源肥大細胞的鑒定 5周后收集培養(yǎng)細胞于離心管中，低速離心5 min，棄去上清液，并用PBS重懸，調整細胞濃度至1×106/ml，從中吸取100 μl于流式管中，分別加入0.5 μl的PE-CD117、0.2 μl的FITC-FcεRIα，避光孵育30 min，用PBS洗2次，行流式細胞分析。肥大細胞的甲苯胺藍染色：用1%甲苯胺藍染液染色30 s，將染色的細胞懸液滴到防脫片上，超凈臺上風干，并用2%的冰乙酸脫色，雙蒸水洗滌后，于光鏡下觀察。細胞免疫熒光染色：收集肥大細胞于EP管中，4%的多聚甲醛固定后，PBS洗3次，每次5 min，5%山羊血清和0.5%BSA室溫封閉1 h，離心后加入肥大細胞類胰蛋白酶(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜，加入羊抗鼠熒光二抗(1 ∶1 000)，室溫孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，最后DAPI染色，封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3骨髓源肥大細胞外泌體的分離純化 用去外泌體血清培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓源肥大細胞48 h，收集細胞上清液，首先將細胞上清液以4 ℃，275 r/min離心10 min去除懸浮細胞；然后將細胞上清液轉移至新的離心管中，以4 ℃、1 836 r/min離心10 min去除細胞碎片；再將細胞上清液轉移至離心管中，以4 ℃、3 000 r/min離心30 min進一步去除微囊泡；再用0.22 μm濾器過濾，分裝至6個體積為14 ml的超速離心管，以4 ℃、24 000 r/min離心70 min，小心吸取離心管上清液，用1 ml PBS吹打管底，并將各管中重懸的外泌體匯聚至1個14 ml超速離心管中，用PBS補足離心管3/4的體積，并在4 ℃、24 000 r/min 離心70 min，最后小心棄去上清液并用PBS重懸，凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.4骨髓源肥大細胞外泌體的鑒定

肝癌為臨床常見惡性腫瘤,發(fā)病隱匿,多數患者出現臨床癥狀時已為晚期,5年存活率<10%。因此,肝癌早期診斷具有重要意義,甲胎蛋白(AFP)為臨床診斷肝癌的常見血清腫瘤標記物,但其敏感性約39%~64%,特異性約為76%~91%,易出現誤診、漏診情況,給臨床診斷和治療帶來不便[1]。研究指出[2],肝癌組織因各因素導致PIVKA-II釋放入血,但其作用機制尚未完全明確。

1.2.4.1透射電鏡檢測外泌體 取少量外泌體5～10 μl， 并用PBS溶液稀釋10倍，吸取適量稀釋后的外泌體懸液于2 mm的銅網上，室溫靜置2 min后用濾紙將多余液體輕輕吸去，用4%醋酸雙氧鈾液室溫負染1 min，于透射電鏡下觀察并拍照。

1.2.4.2粒徑檢測分析外泌體 使用Nanosight儀器測量提取的外泌體直徑大小。取新鮮適量樣品用PBS稀釋3 000倍，然后添加到納米孔中進行測量，使用Nanosight儀器分析得到的外泌體顆粒大小。

1.2.4.3Western blot檢測外泌體標志性蛋白 每孔各加入外泌體樣品與細胞蛋白30 μg，于10% SDS-PAGE電泳至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，并稀釋一抗Alix(1 ∶1 000)、CD63(1 ∶1 000)、TSG101(1 ∶1 000)、Tryptase (1 ∶1 000)及Calnexin(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入羊抗兔二抗(1 ∶1 000)，溫室下孵育1 h，顯影。

1.2.5肝癌Hepa1-6細胞攝取骨髓源肥大細胞外泌體 將Hepa1-6細胞以1×105/孔接種于6孔板中，10 μl PKH67標記的外泌體加入到6孔板中，在不同的時間點觀察攝取情況，并用熒光顯微鏡拍照。

1.2.6細胞增殖實驗 使用CCK-8和Edu檢測細胞增殖情況，將肝癌細胞以1×103個細胞/孔接種于96孔板中，實驗組分別用5、10、20 μg/ml濃度的骨髓源肥大細胞外泌體處理Hepa1-6細胞72 h, 對照組加入等體積的培養(yǎng)基。向每孔中加入10 μl的CCK-8試劑，將細胞置于37 ℃中保持2 h。酶標儀A450 nm測定吸光度(optical density,OD)。將肝癌細胞以1×105/孔接種于12孔板，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，實驗組分別用5、10、20 μg/ml濃度的骨髓源肥大細胞外泌體處理24 h，使用Edu試劑標記增殖細胞，在熒光顯微鏡下觀察并拍照計數。

1.2.7細胞劃痕實驗 用無菌槍頭垂直于6孔板的正中劃一條線，PBS洗去劃下的細胞，對照組加入等體積的正常培養(yǎng)基，實驗組分別加入5、10、20 μg/ml的骨髓源肥大細胞外泌體。

1.2.8細胞侵襲實驗 使用Transwell小室檢測細胞的侵襲能力，將1×105個細胞接種到無血清培養(yǎng)基200 μl的上室內,下室加入500 μl含有5、10、20 μg/ml骨髓源肥大細胞外泌體的完全培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h。用75%的乙醇固定15 min，0.1%的結晶紫染色10 min，在顯微鏡下觀察細胞侵襲并拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理使用軟件Image J進行數據采集，采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數據均以表示，組間數據采用t檢驗進行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠原代骨髓源肥大細胞的鑒定5周后光鏡下觀察到成熟的骨髓源肥大細胞形態(tài)呈大小均一圓形，細胞膜邊緣有絲狀偽足突起；胞質內含有異染性顆粒。見圖1A。與甲苯胺藍結合后細胞質被染成紫紅色，胞核染成藍色，表明獲得的肥大細胞具有吞噬甲苯胺藍的特性，鏡下統(tǒng)計超過95%的細胞都是成熟的肥大細胞。見圖1B。流式細胞儀分析得到CD117與FcεRIα雙陽性的骨髓源肥大細胞比例達到95.1%，見圖1C、D,說明獲得的肥大細胞具有較高的純度；細胞免疫熒光顯示：細胞質內含有大量的被標記的綠色熒光，即類胰蛋白酶陽性的肥大細胞。見圖1E。

圖1 骨髓源肥大細胞鑒定A: 骨髓源肥大細胞光鏡圖 ×200；B: 骨髓源肥大細胞甲苯胺藍染色 ×200；C、D：骨髓源肥大細胞流式鑒定同型對照圖、陽性對照圖；E: 免疫熒光染色 ×400；1:DAPI;2:Tryptase;3:Merge

2.2 外泌體的鑒定骨髓源肥大細胞外泌體呈大小不均一的橢圓形或圓杯形，像“泄了氣的球形”結構，且外泌體形態(tài)結構清楚，染色背景干凈，有完整的膜形結構。見圖2A、B。Nanosight結果提示骨髓源肥大細胞外泌體的顆粒直徑在30～150 nm之間。見圖2C、D。Western blot驗證顯示骨髓源肥大細胞外泌體表達Alix、CD63、Tryptase和TSG101蛋白，而Calnexin蛋白只在細胞中有表達。見圖2E。

2.3 肝癌Hepa1-6對骨髓源肥大細胞外泌體的攝取用PKH67試劑標記骨髓源肥大細胞外泌體，將標記后的外泌體與肝癌Hepa1-6細胞共培養(yǎng)，分別在0、6、24 h后，在熒光顯微鏡下觀察外泌體被肝癌細胞所攝取的情況，鏡下可見：隨著時間的延長，Hepa1-6細胞核周圍聚集的外泌體數量明顯增加,實驗結果提示骨髓源肥大細胞外泌體可被Hepa1-6細胞攝取。見圖2F。

圖2 骨髓源肥大細胞外泌體鑒定及攝取情況A、B: 骨髓源肥大細胞外泌體透射電鏡圖 ×3 000；C、D: 粒徑檢測分析骨髓源肥大細胞外泌體濃度及顆粒分布 ×50；E: Western blot分析骨髓源肥大細胞外泌體蛋白(CD63、Alix、TSG101、Calnexin和Tryptase)表達；F: 不同時間肝癌Hepa1-6對骨髓源肥大細胞外泌體的攝取情況 ×200

2.4 骨髓源肥大細胞外泌體促進肝癌Hepa1-6細胞增殖CCK-8和Edu實驗能很好地反應細胞的增殖能力。采用其測定骨髓源肥大細胞外泌體對Hepa1-6細胞增殖的影響。CCK-8實驗結果示，與對照組相比，濃度為10 μg/ml和20 μg/ml外泌體處理Hepa1-6細胞后在72 h測得OD值顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.106,P<0.05；t=14.44,P<0.01)，而濃度為5 μg/ml時對Hepa1-6細胞增殖能力無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義。見圖3A。Edu實驗結果示Edu陽性細胞比例5 μg/ml組為(40.2±1.64)%，10 μg/ml組(59±1.58)%，20 μg/ml組(84.8±2.86)%，與對照組(38.2±1.92)%相比，在低濃度為5 μg/ml時，其對Hepa1-6細胞增殖能力影響較弱，當濃度為10 μg/ml和20 μg/ml時Hepa1-6細胞增殖能力明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，表明肥大細胞外泌體能夠促進Hepa1-6細胞的增殖，并具有濃度依賴性。見圖3B。

圖3 不同濃度的骨髓源肥大細胞外泌體對Hepa1-6細胞增殖的影響A:CCK-8檢測各組細胞增殖情況；B:Edu陽性細胞 ×400；1:對照組；2:5 μg/ml組；3:10 μg/ml組；4:20 μg/ml組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5 骨髓源肥大細胞外泌體促進肝癌Hepa1-6細胞遷移和侵襲劃痕實驗用來評估細胞的遷移能力(圖4A、B)。劃痕實驗結果表明：5、10、20 μg/ml組細胞劃痕遷移率分別為(25.3±3.19)%、(41.4±2.07)%、(58.9±2.61)%，對照組劃痕遷移率為(20.2±2.28)%，當5 μg/ml處理24 h后，Hepa1-6細胞遷移能力無明顯改變，當濃度為10 μg/ml和20 μg/ml時，Hepa1-6細胞遷移效果明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。采用Transwell實驗檢測骨髓源肥大細胞外泌體對Hepa1-6細胞侵襲能力的影響,實驗結果表明5、10、20 μg/ml組穿過基膜的細胞數分別為(46.4±3.51)、(76.2±4.60)、(97±5.24)個/視野，較對照組穿過基膜的細胞數(33.8±3.11)個/視野，差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為<0.05，<0.05，<0.01)。見圖4C。表明肥大細胞外泌體對Hepa1-6細胞的遷移和侵襲能力具有促進作用。

圖4 不同濃度的骨髓源肥大細胞外泌體對Hepa1-6細胞遷移和侵襲的影響 ×200A:0 h細胞劃痕觀察各組細胞的遷移情況；B: 24 h細胞劃痕觀察各組細胞的遷移情況；C:Transwell檢測各組細胞的侵襲情況；1:對照組；2:5 μg/ml組；3:10 μg/ml組；4:20 μg/ml組

3 討論

近年來，外泌體的功能得到廣泛關注。外泌體是由細胞產生和釋放的胞外微小囊泡，作為一種活躍的生物容器，外泌體中含有多種蛋白質、lncRNA和DNA等生物活性物質。越來越多的證據表明，外泌體作為細胞間通訊的載體，通過介導腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞與基質細胞間的相互作用，進而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、血管生成和轉移中發(fā)揮重要作用。此外，研究[9]發(fā)現外泌體還可作為腫瘤的診斷標志物、潛在的治療靶點以及藥物遞送系統(tǒng)。

肥大細胞源于骨髓中的骨髓祖細胞，并遷移至周圍組織中分化成熟[10]。肥大細胞作為免疫系統(tǒng)的第一道防線，除在過敏反應中起主導作用外，還與免疫、炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。Lotvall et al[11]首先在肥大細胞分泌的外泌體中發(fā)現有功能性RNA，這類外泌體RNA具有在細胞之間的傳遞和轉移信息的作用。此外，肥大細胞系HMC-1分泌的KIT蛋白，通過外泌體與腫瘤細胞相互作用，隨后激活胞內KIT-SCF信號通路，從而促進肺癌細胞的增殖[12]。但是，關于骨髓來源的肥大細胞分泌的外泌體研究甚少。本研究探討了骨髓源肥大細胞外泌體對肝癌Hepa1-6細胞的增殖、遷移和侵襲的影響。采用超速離心法從小鼠骨髓源肥大細胞培養(yǎng)上清中提取外泌體，以濃度梯度的方式處理肝癌細胞Hepa1-6，通過CCK-8實驗、Edu實驗、劃痕實驗和侵襲實驗檢測顯示，當外泌體濃度為10 μg/ml時，骨髓源肥大細胞分泌的外泌體能夠明顯促進肝癌Hepa1-6細胞增殖、遷移和侵襲。這為后續(xù)進一步探索肥大細胞外泌體在肝癌中的相關機制研究奠定了基礎。

目前，外泌體的提取方法有很多，包括基于超速離心的分離、免疫學分離、超濾分離和基于聚合物的沉淀分離等[13]，但并沒有統(tǒng)一的標準，其中超速離心是目前應用最廣泛的外泌體提取方法，超速離心法除了操作簡單、成本低、外泌體純度高等優(yōu)點，同時提取的外泌體能夠保留完整的囊泡結構，并能保持其表面蛋白的特異性和mRNA成分的活性。本實驗通過超速離心法從肥大細胞上清中提取外泌體，并通過透射電鏡觀察，Nanosight粒徑分析和Western blot檢測標志蛋白均證實為外泌體。