葉倩舲，宋明珠，王會平，肖 浩，翟志敏

急性髓系白血病發(fā)病機制復雜，據(jù)既往有無治療和疾病史，通常可將其分為原發(fā)性急性髓系白血病(primary acute myeloid leukemia，P-AML)和繼發(fā)性髓系白血病(secondary acute myeloid leukemia，S-AML)兩類。S-AML是指前期存在骨髓增生異常綜合征或有明確職業(yè)及環(huán)境暴露史 ，或繼發(fā)于放、化療之后所形成的白血病[1]。與P-AML比較，S-AML發(fā)病率較低，但治療過程更為復雜，生存期更短，預后更差[2]。該文旨在了解與分析S-AML患者的T細胞亞群，為進一步探究其發(fā)病機制奠定相關的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病例資料2010年1月～2019年11月安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院收住的17例S-AML患者、23例P-AML患者。

1.2 主要試劑與儀器CD25-FITC、CD127-PE、CD4-PC5、CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5試劑盒，以及相關同型對照抗體購自美國Beckman-Coulter公司；溶血劑為0.83%的氯化銨溶液，由本實驗室加去離子蒸餾水自行配制；流式細胞儀為美國Beckman-Coulter公司臨床應用型流式細胞儀FC500，分析軟件為CXP軟件。

1.3 實驗方法外周靜脈血2 ml，肝素鈉抗凝。采用直接熒光法標記細胞膜表面各個抗原(包括CD3、CD4、CD8、CD25和CD127)，檢測不同T淋巴細胞亞群比：識別總T淋巴細胞(CD3+T細胞)、輔助性T淋巴細胞(CD3+CD4+T細胞)、細胞毒性T淋巴細胞(CD3+CD8+T細胞)、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞，CD4+CD25+CD127low)和活化效應性T細胞(Teff細胞群，CD4+CD25+CD127hi)。具體方法如下：取2個試管分別加入抗凝全血100 μl，其中一管加入檢測抗體各10 μl，另一管加入相應的同型對照抗體各10 μl，混勻后室溫下避光反應15 min；加溶血劑1 000 μl混勻，室溫下放置10 min；立即上流式細胞儀檢測。

開機后對流式細胞儀進行光路和流路質(zhì)量控制和熒光補償，使儀器各項指標在質(zhì)量控制的允許值范圍。檢測樣本時根據(jù)前向散射光信號( forward sCattering，F(xiàn)SC)和側(cè)向散射光信號(side sCattering，SSC)對淋巴細胞群設門，每份標本獲取淋巴細胞10 000個以上，數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存。

1.4 統(tǒng)計學處理Excel 2007錄入數(shù)據(jù)，IBM-SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布采用均值標準差描述，組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義時采用LSD法進行多組間兩兩比較；偏態(tài)分布資料采用M(P25，P75)描述，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，差異有統(tǒng)計學意義時采用Mann-Whitney U檢驗進行多組間兩兩比較(調(diào)整檢驗水準α=0.017)；定性資料組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料S-AML患者17例，男10例，年齡25～78(56.94±16.52)歲；陽性對照組，P-AML患者23例，男10例，年齡20～82(56.74±16.44)歲；健康對照34例，男13例，年齡26～77(48.38±14.95)歲。3組年齡(F=2.629，P=0.079)、性別(χ2=1.961，P=0.375)間差異無統(tǒng)計學意義。其中S-AML、P-AML診斷均符合世界衛(wèi)生組織急性髓系白血病診斷標準。S-AML組患者一般信息見表1。

表1 S-AML組研究對象一般情況

2.2 不同T淋巴細胞亞群的檢測結(jié)果Treg細胞在3組間差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.001)，其中S-AML組Treg水平高于健康對照組與P-AML組(P<0.05)，P-AML組高于健康對照組(P<0.05)；Treg/Teff比例在3組間差異也存在統(tǒng)計學意義(P=0.014)，S-AML組比值高于健康對照組 (P=0.009)。與健康對照組相比，P-AML和S-AML患者其余的T細胞亞群包括CD3+CD4+T、CD3+CD8+T細胞數(shù)量及CD4/CD8比值差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 S-AML、P-AML與對照組T淋巴細胞亞群各亞群檢測結(jié)果

3 討論

繼發(fā)性白血病由外國學者Smit et al[3]于1970年首次報道，發(fā)病率遠低于P-AML。由于該病致病因素復雜，人們雖對其發(fā)病機制進行了近50年的探索，然而迄今尚無法明確它的病理機制?，F(xiàn)一般被分為兩類：一類為實體腫瘤經(jīng)過綜合化療繼發(fā)的S-AML，認為與拓撲異構(gòu)酶抑制劑、烷化劑等化療治療相關；另一類則由多種髓系相關血液疾病轉(zhuǎn)化形成，包括骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)、原發(fā)性骨髓纖維化( primary myelofibrosis，PMF)、慢性髓系白血病( chronic myeloid leukemia，CML)等，其中以MDS為主，這一類疾病均有著不同程度向急性白血病轉(zhuǎn)化的風險。

MDS是一組起源于異質(zhì)性惡性造血干祖細胞的克隆性疾病，特征包括血細胞異型增生、無效造血，多見于老年人，具有程度不一的急性白血病轉(zhuǎn)化風險；造血細胞從正常的干細胞轉(zhuǎn)化成MDS細胞是一個復雜的過程，包括基因突變、抑癌基因缺失或功能不全、以及與分化增殖有關的信號傳導異常等[4]。PMF、CML等這一類骨髓增殖性疾病，其主要特點包括骨髓纖維組織增生，一系或多系髓系細胞過度增殖以致外周血過度聚集，疾病終末期多形成無效造血及轉(zhuǎn)化為急性白血病[5-6]。相較于原發(fā)性白血病，上述髓系血液系統(tǒng)疾病患者一旦轉(zhuǎn)化為急性白血病，自然病程更短，對化療藥物反應敏感性及反應性均較差，給臨床治療帶來極大困難。Treg細胞是機體內(nèi)一群特殊的免疫細胞，在人類外周血CD4+T細胞中不足10%，但具有免疫抑制和免疫無能功能，被認為在腫瘤性疾病中發(fā)揮著重要作用[7]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、消化系統(tǒng)腫瘤、急性淋巴細胞白血病等多種腫瘤性疾病中，Treg細胞水平均明顯升高[8-9]，這可能是因為Tregs細胞能夠抑制T、B淋巴細胞、NK、NKT等多種免疫細胞功能，導致機體處于免疫抑制狀態(tài)，從而使腫瘤發(fā)生的風險升高[10-11]。

因此，對S-AML這種血液腫瘤的Treg細胞進行檢測與分析有著重要的臨床意義。本研究表明，S-AML患者的Treg細胞比例及Treg/Teff細胞比值明顯高于健康對照及P-AML，提示這一類型白血病免疫狀態(tài)向抑制性偏移，其免疫失衡更為嚴重。Treg細胞的改變可能是S-AML形成的重要誘因之一，同時，S-AML患者化療效果不佳及生存期短也極有可能是由Treg細胞的改變造成的。

現(xiàn)今，隨著免疫學新技術的快速發(fā)展，去除機體某些特定細胞的技術日臻成熟。近期已有學者[12]提出在治療急性白血病及其它惡性腫瘤過程中，可以將對Treg細胞水平的調(diào)控作為一個新的潛在靶點。而S-AML患者免疫狀態(tài)更為失衡，外周血Treg細胞數(shù)量異常升高，降低或去除機體Treg細胞，使機體免疫抑制狀態(tài)解除，以及通過各種方式提高機體免疫功能，都有可能成為今后延緩S-AML病程，甚至達到治療目的的手段。而在大劑量化學治療的同時，找到如何調(diào)控機體免疫平衡這一研究亮點可能也為治療該類白血病提供新的方向。