王 鵬，陳 曦，徐 恰，劉 會(huì)，郭若文，劉 蕓，許 尹，秦宜德

卵巢癌是臨床上常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，死亡率位于婦科惡性腫瘤首位[1]，由于化療藥物的使用會(huì)使患者產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致臨床上治療效果不理想，臨床需要更加有效的治療方案。研究[2]表明OPTN基因在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面起著重要的作用，OPTN蛋白通過(guò)激活細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，其中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α超家族成員(factor associated suicide, Fas)在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中起著重要作用。Fas是一種I型跨膜糖蛋白通過(guò)與三聚化的Fasl結(jié)合而被激活，激活后的Fas可以通過(guò)下游的接頭蛋白FADD與caspase8蛋白形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合物(death inducing signaling complex,DISC),DISC激活下游的caspase3引發(fā)細(xì)胞凋亡[3]，同時(shí)DISC還催化Bcl-2家族成員Bid前體，形成截?cái)嘈图せ钚虰id(turn-cated Bid，tBid),激活的tBid轉(zhuǎn)位到線粒體觸發(fā)Bax和Bax同源寡聚作用啟動(dòng)細(xì)胞色素C的釋放啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[4],降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株、菌株、質(zhì)粒載體 本實(shí)驗(yàn)所使用的SKOV3細(xì)胞、293 T細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室所保存；TOP 10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；敲除質(zhì)粒PX 459、包裝質(zhì)粒psPAX 2和pMD 2.G由本實(shí)驗(yàn)室保存；慢病毒質(zhì)粒pGPU 6_GFP_Neo購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑 順鉑注射液購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Promega公司；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT、Mix Taq酶購(gòu)自日本Takara公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供；β-actin鼠抗人抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；caspase3、Bax、Bcl-2抗體購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞SKOV3用DMEM(10%胎牛血清+雙抗)培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，觀察細(xì)胞待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶70%～80%時(shí)，用0.4%的胰蛋白酶消化，用于傳代、凍存或其他實(shí)驗(yàn)。

1.2.2慢病毒的構(gòu)建及包裝 OPTN特異性shRNA序列選自Sigma網(wǎng)站從中選取序列，sgRNA從http://crispr.mit.edu/網(wǎng)站設(shè)計(jì)得到,由上海生工生物有限公司合成。見(jiàn)表1。將退火后的引物與酶切后的載體連接，轉(zhuǎn)化TOP 10大腸桿菌、挑選陽(yáng)性克隆、提取質(zhì)粒由上海生工生物有限公司測(cè)序驗(yàn)證。取成功構(gòu)建的重組載體分別和包裝質(zhì)粒(psPAX 2、pMD 2.G)共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)基換成不含血清的DMEM。轉(zhuǎn)染后混合培養(yǎng)8 h更換含10%血清的DMEM培養(yǎng)基載體帶有綠色熒光基因，48 h后觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后48、72 h，3 000 r/min 離心15 min收集含有病毒的上清液,-80 ℃儲(chǔ)存、備用。

表1 shRNA和sgRNA的序列

1.2.3病毒滴度的測(cè)定 滴度測(cè)定使用的是Cell Bio Labs’Quick Titertm慢病毒滴度試劑盒，測(cè)定前將293 T細(xì)胞消化并鋪入96孔板里100 μl每孔，每個(gè)病毒設(shè)置10個(gè)孔。感染當(dāng)日將病毒上清液在EP管里做10個(gè)10倍梯度稀釋。棄去培養(yǎng)基，加入病毒液100 μl/孔，24 h后加入100 μl/孔新鮮培養(yǎng)液。72 h后觀察并計(jì)數(shù)。病毒滴度(TU/ml)=熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)×稀釋倍數(shù)/病毒體積(ml)。

1.2.4慢病毒感染SKOV3細(xì)胞及穩(wěn)定敲低株和敲除株的篩選 接種狀態(tài)良好的SKOV3細(xì)胞到6孔板中，密度在60%～80%，待細(xì)胞貼壁后，按照病毒定量結(jié)果加入病毒上清液。6 h后更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后加入新霉素2.2 μg/ml(敲低)和2.5 μg/ml的嘌呤霉素(敲除)繼續(xù)篩選培養(yǎng)兩周至單克隆細(xì)胞群的形成。

1.2.5敲減和敲除OPTN基因的檢測(cè) 在NCBI上找到OPTN基因的全序列，在OPTN基因的第一個(gè)外顯子區(qū)域上的sgRNA靶點(diǎn)上下游進(jìn)行設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)的引物序列為F：5′-CTGCCGCCCGGCTTGGC-3′, R： 5′-GGCGCGGGCAGGGAGCG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為220 bp。β-actin序列為F: 5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′, R：5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為434 bp。提取細(xì)胞中的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行敲減OPTN的鑒定；提取細(xì)胞中基因組DNA并根據(jù)引物序列進(jìn)行敲除OPTN在基因組DNA水平上的鑒定。

1.2.6MTT檢測(cè)順鉑(cisplatin，DDP)對(duì)4組細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液按照每孔5 000細(xì)胞接種96孔板中培養(yǎng)過(guò)夜。分為4組細(xì)胞加藥：WT組(正常對(duì)照組)、NC組(非特異性轉(zhuǎn)染組)、sh組(特異性轉(zhuǎn)染敲低組)、KO組(敲除組)。濃度設(shè)置為1、2、4、8、16、32 μmol/L的DDP，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μl的MTT溫箱繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm的吸光度(optical density,OD)值(OD490nm),以正常對(duì)照組計(jì)算用藥組的生長(zhǎng)抑制率。計(jì)算公式為：抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD正常對(duì)照組)×100%。

1.2.7qRT-PCR法檢測(cè)Bax、Bcl-2、caspase3的mRNA的表達(dá)情況 培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞，分為4組：WT+DDP(IC50)組、NC+DDP(IC50)組、sh+DDP(IC50)組、KO+DDP(IC50)組。培養(yǎng)48 h使用TRIzol提取細(xì)胞中總RNA，DEPC水溶解-80 ℃保存。使用Thermo試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,用ABI 7500型定量PCR儀檢測(cè)。所有引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，見(jiàn)表2。SYBR Green PCR 試劑盒被用來(lái)進(jìn)行qPCR，qPCR反應(yīng)體系10 μl為：SYBR Premix Ex TaqII(2×)5 μl,上/下游引物各0.5 μl,cDNA 2 μl，RNase Free dH2O 2 μl。反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s。每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

表2 引物的序列

1.2.8Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Procaspase3、Cleaved-caspase3的蛋白的表達(dá)情況 將培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞分為4組：WT+DDP(IC50)組、NC+DDP(IC50)組、sh+DDP(IC50)組、KO+DDP(IC50)組。

培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞總蛋白，經(jīng)12%的SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，按順序孵育抗體[Bax、Bcl-2、Procaspase3、Cleaved-caspase3一抗(1 ∶2 000)，辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶10 000)]，顯色并進(jìn)行灰度值的分析。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建pGPU 6_GFP_Neo-shOPTN、pGPU 6_GFP_Neo-NC慢病毒質(zhì)粒及PX 459敲除質(zhì)粒經(jīng)酶切后的pGPU 6_GFP_Neo和PX 459質(zhì)粒與退火后的shRNA和sgRNA連接產(chǎn)生重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸TOP 10大腸桿菌，長(zhǎng)出克隆后提取質(zhì)粒，由上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序證實(shí)插入序列正確，說(shuō)明成功構(gòu)建載體。見(jiàn)圖1。

圖1 重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果

2.2 SKOV3細(xì)胞中敲低前后OPTN基因的表達(dá)量的變化將經(jīng)篩選得到的細(xì)胞株使用TRIzol提取細(xì)胞中總RNA。使用Thermo試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA并根據(jù)設(shè)計(jì)的引物序列進(jìn)行RT-PCR,產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳分離，并用凝膠成像系統(tǒng)分析。圖2顯示sh組的OPTN基因的表達(dá)量低于WT組和NC組。

圖2 RT-PCR檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中敲低OPTN的基因表達(dá)量的變化A： OPTN基因表達(dá)量的變化；B： β-actin的表達(dá)量；1：WT組；2：NC組；3：sh組；M：Marker

2.3 SKOV3細(xì)胞中敲除OPTN在基因組DNA水平上的驗(yàn)證將經(jīng)篩選后的敲除組SKOV3細(xì)胞利用天根生化科技公司的細(xì)胞基因組DNA的提取試劑盒，按照其說(shuō)明書(shū)提取SKOV3細(xì)胞的基因組DNA，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物序列進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示與WT組相比KO組沒(méi)有P出條帶，說(shuō)明在靶點(diǎn)附近的DNA片段被敲除。見(jiàn)圖3。

圖3 敲除OPTN在基因組DNA水平上的鑒定A：OPTN基因DNA的PCR結(jié)果；B：β-actin的PCR結(jié)果；1、2：WT組；3、4：KO組；M：Marker

2.4 SKOV3細(xì)胞中敲減和敲除OPTN的蛋白檢測(cè)提取經(jīng)新霉素篩選2周后的慢病毒感染的敲低株SKOV3細(xì)胞總蛋白。提取由慢病毒感染的SKOV3細(xì)胞并由嘌呤霉素篩選后獲得的敲除株單克隆細(xì)胞株的總蛋白。并用Western blot法分析結(jié)果顯示在蛋白水平上敲低的sh組OPTN蛋白的表達(dá)量相對(duì)于WT組和NC組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=132.13,Mean1=1.137,Mean2=1.104,Mean3=0.3062,SD=0.38,P<0.01)。KO組與WT組相比OPTN蛋白不表達(dá)。因此成功構(gòu)建穩(wěn)定的敲低和敲除OPTN基因的SKOV3細(xì)胞株。見(jiàn)圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中OPTN蛋白的表達(dá)A：敲減；B：敲除；1：WT組；2：NC組；3：sh組；4、5：WT組；6、7：KO組;與WT組比較：**P<0.01

2.5 OPTN對(duì)DDP抑制SKOV3細(xì)胞增殖的影響使用1、2、4、8、16、32 μmol/L濃度的DDP作用于人SKOV3細(xì)胞48 h，MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，得出WT、NC、sh、KO 4組細(xì)胞的IC50值分別為1.903、1.82、3.369、3.613 μmol/L。MTT檢測(cè)結(jié)果也顯示sh組和KO組的細(xì)胞抑制率明顯低與WT組和NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FWT=16.546,FNC=17.76，F(xiàn)sh=26.65,FKO=28.75；MeanWT=62.06，MeanNC=62.89，Meansh=40.44，MeanKO=34.04；SDWT=27.27，SDNC=26.47，SDsh=29.16，SDKO=29.07；P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖5，顯示OPTN增加SKOV3細(xì)胞對(duì)DDP抑制的敏感性。

圖5 OPTN對(duì)DDP抑制SKOV3細(xì)胞增殖的影響與WT組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.6 OPTN對(duì)Bax、Bcl-2、caspase3的mRNA表達(dá)的影響qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，OPTN蛋白的sh和KO組，與WT組相比，Bax、caspase3表達(dá)量降低，Bcl-2表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fcaspase3=53.07，F(xiàn)Bax=25.18，F(xiàn)Bcl-2=35.50，Meancaspase3=0.7442，MeanBax=0.7668，MeanBcl-2=0.666 6；SDcaspase3=0.18，SDBax=0.23，SDBcl-2=0.12；P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖6。

圖6 qRT-PCR檢測(cè)caspase3、Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)量1：caspase3；2：Bax；3：Bcl-2；與WT組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.7 OPTN對(duì)Bax、Bcl-2、Procaspase3、Cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，OPTN蛋白的敲低和敲除組Bax、caspase3蛋白表達(dá)量降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FCleaved-caspase3=27.15，F(xiàn)Procaspase3=21.09，F(xiàn)Bax=36.48，F(xiàn)Bcl-2=29.76；MeanCleaved-caspase3=0.556，MeanProcaspase3=0.754，MeanBax=0.638，MeanBcl-2=1.244；SDCleaved-caspase3=0.113，SDProcaspase3=0.127，SDBax=0.106，SDBcl-2=0.197；P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖7。

圖7 Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase3、Procaspase3、Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)量A：蛋白表達(dá)量的變化；B：Cleaved-caspase3的蛋白柱狀分析圖；C：Procaspase3的蛋白柱狀分析圖；D：Bax的蛋白柱狀分析圖；E：Bcl-2的蛋白柱狀分析圖；1：WT組+DDP(IC50)；2：NC+DDP(IC50)；3：sh+DDP(IC50)；4：KO+DDP(IC50)；與WT+DDP(IC50)組比較：*P<0.05,**P<0.01

3 討論

RNA干擾技術(shù)是指外源或者內(nèi)源性雙鏈RNA(dsRNA)與細(xì)胞同源mRNA序列結(jié)合，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因的沉默，阻斷靶基因的表達(dá)。dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后被核酸內(nèi)切酶Ⅲ(Dicer)切割成21～23 nt的雙鏈小干擾RNA即siRNA[5]，siRNA與體內(nèi)解旋酶及其他因子結(jié)合形成復(fù)合物即RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)[6]。RISC具有核酸酶的功能利用siRNA反義鏈切割靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA降解[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用了RNA干擾技術(shù)對(duì)SKOV3細(xì)胞OPTN基因進(jìn)行敲低，并成功獲得了穩(wěn)定敲低OPTN蛋白的SKOV3細(xì)胞株[9]。

CRISPR/Cas9技術(shù)是近年來(lái)興起的一項(xiàng)基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9是一種來(lái)自細(xì)菌降解入侵病毒DNA或其他外源DNA的免疫機(jī)制[10]。Cas9蛋白含有2個(gè)核酸酶的結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結(jié)合形成復(fù)合物通過(guò)PAM序列結(jié)合并侵入DNA形成RNA-DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)目的DNA雙鏈進(jìn)行切割，使DNA雙鏈斷裂[11]。細(xì)胞會(huì)對(duì)斷裂部分進(jìn)行修復(fù)，在修復(fù)的過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致基因的移碼突變、替換或刪除，致使基因功能喪失[12]。本實(shí)驗(yàn)所采用的是CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)SKOV3細(xì)胞OPTN基因進(jìn)行敲除，根據(jù)OPTN基因的外顯子設(shè)計(jì)sgRNA并與表達(dá)Cas9蛋白的質(zhì)粒載體連接，在sgRNA的導(dǎo)向下Cas9識(shí)別含有PAM的靶序列并把雙鏈DNA進(jìn)行斷裂達(dá)到敲除OPTN蛋白的作用。

OPTN蛋白在卵巢癌細(xì)胞中屬于高表達(dá)蛋白，其在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面起著重要的作用[13-14]。實(shí)驗(yàn)顯示OPTN可能通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，使下游凋亡基因Bax、caspase3表達(dá)量增加，Bcl-2表達(dá)量降低。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA干擾技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)SKOV3細(xì)胞的OPTN基因進(jìn)行敲低和敲除，結(jié)果顯示敲低和敲除OPTN基因的細(xì)胞不易發(fā)生凋亡，對(duì)DDP的敏感性降低。這也說(shuō)明OPTN可以促進(jìn)抑制SKOV3細(xì)胞的增殖，促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡，并使SKOV3細(xì)胞對(duì)DDP耐藥性的下降，具體的耐藥性機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。