吳 仲,李 曦,韓 徐,丁 玲, 祝勁松, 王凌浩

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion, CI/R)是一個(gè)復(fù)雜的快速級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，發(fā)病后再次灌注，不僅損傷無法恢復(fù)，其損傷會(huì)繼續(xù)加重，嚴(yán)重威脅人類的健康[1-2]。腦組織中一旦發(fā)生缺血后會(huì)發(fā)生炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、凋亡基因激活和一系列信號(hào)通路發(fā)生改變，導(dǎo)致不可逆的損傷[3-6]。丙泊酚是一種常見的靜脈麻醉藥，多用于腫瘤切除的麻醉[7]。丙泊酚可以通過調(diào)節(jié)核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路和炎癥反應(yīng)因子活性，對(duì)心腦血管起到保護(hù)作用[8]。目前有關(guān)丙泊酚能否通過降低CI/R后氧化應(yīng)激來保護(hù)CI/R研究較少。該文旨在研究丙泊酚抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extraeellular—signalregulatedki-nase,ERK1/2)和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB) 的活化緩解CI/R大鼠神經(jīng)功能損傷及氧化應(yīng)激的影響，以期了解丙泊酚抑制ERK1/2和NF-κB p65的活化緩解CI/R大鼠神經(jīng)功能損傷及氧化應(yīng)激作用機(jī)理，從而為CI/R的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)2.5～3.5周齡SD大鼠75只，體質(zhì)量(60±6) g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0022，普通級(jí)，所有大鼠均飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物學(xué)部屏障環(huán)境獨(dú)立通氣籠，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，實(shí)驗(yàn)經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 藥物與試劑中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司；蘇木精、伊紅購自武漢博士得生物有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)檢測(cè)試劑盒均購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；LipofecamineTM2000購自美國ThermoFisher公司；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR PCR Master Mix試劑盒購自日本Toyobo公司。

1.3 儀器TDL-5 型臺(tái)式離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；3～5 w低溫離心機(jī)購自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；SG-51正置型金相顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；BS-124s型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)購自以色列DNR公司；LD-66實(shí)驗(yàn)室切片機(jī)購自長沙益廣制藥機(jī)械公司。

1.4 方法

1.4.1分組及建立模型 將75只大鼠隨機(jī)均分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組。將模型組、低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠麻醉并仰臥固定，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，使用微動(dòng)脈夾夾閉10 min，松開10 min，再夾閉10 min，再次松開，共2個(gè)周期，復(fù)制大鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型；具體制作方法和判讀造模是否成功參考Watanabe et al[9]研究。

1.4.2藥物干預(yù) 低劑量丙泊酚組于制作模型前腹腔注射丙泊酚，注射總劑量為36 mg/kg；高劑量丙泊酚組于制作模型前腹腔注射丙泊酚，注射劑量為72 mg/kg；陽性對(duì)照組于制作模型前腹腔注射尼莫地平，注射劑量為16 mg/kg；假手術(shù)組和模型組于制作模型前腹腔注射等量生理鹽水，丙泊酚注射劑量參考薛青 等[10]研究。

1.4.3檢測(cè)項(xiàng)目

1.4.31大鼠的神經(jīng)功能檢測(cè) 造模完成后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。本實(shí)驗(yàn)使用國際上公認(rèn)的大鼠腦神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

表1 神經(jīng)功能及姿勢(shì)反射評(píng)分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3.2大鼠腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)檢測(cè) 神經(jīng)評(píng)分后將大鼠處死，立即取腦，切成2 mm的切片，沖洗后避光溫孵、染色并拍照，用 Image-ProPlus 軟件分析計(jì)算腦梗死率。腦梗死率(%)=(梗死區(qū)總面面積/全腦總面積)×100%。取左右腦半球，快速稱質(zhì)量，計(jì)為濕質(zhì)量。放入恒溫干燥箱干燥24 h，取出后稱質(zhì)量，計(jì)為干質(zhì)量。腦含水率(%)=[(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量]×100%。取腦組織用沖洗后除去積血，吸去表面水分稱重，以臟器濕重(mg/g)表示腦指數(shù)。

1.4.3.3Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入1 ∶500稀釋的[腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)、ERK1/2、p-ERK1/2、p65、p-p65]抗體，Actin(1 ∶5 000)，孵育2 h]，以Actin為內(nèi)參蛋白，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3.4RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平 取大鼠大鼠腦前額組織，切碎后用TRIzol試劑提取總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，用SYBR PCR Master Mix試劑盒對(duì)BDNF、NGF表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以Actin為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)所用到的引物均采用Primer 3網(wǎng)站設(shè)計(jì)，由大連Takara公司合成。

1.4.3.5HE染色觀察 使用常規(guī)HE染色，中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下使用10×40的倍鏡觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)變化情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用GraphPad Prism5作圖，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差分析使用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能檢測(cè)結(jié)果圖1顯示，相比假手術(shù)組，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、姿勢(shì)反射評(píng)分、腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、姿勢(shì)反射評(píng)分，腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)降低(P<0.05)。

圖1 神經(jīng)功能評(píng)分、姿勢(shì)反射評(píng)分、腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)檢測(cè)結(jié)果A：大鼠神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果；B：大鼠姿勢(shì)反射評(píng)分結(jié)果；C：大鼠腦梗死率檢測(cè)結(jié)果；D：大鼠腦含水率檢測(cè)結(jié)果；E：大鼠腦指數(shù)檢測(cè)結(jié)果；1: 假手術(shù)組；2：模型組；3:低劑量丙泊酚組；4: 高劑量丙泊酚組；5：陽性對(duì)照組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 大鼠腦BDNF及NGF表達(dá)情況圖2顯示，相比假手術(shù)組，模型組大鼠BDNF、NGF表達(dá)升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠BDNF、NGF表達(dá)降低(P<0.05)。

圖2 Western blot以及RT-PCR法檢測(cè)大鼠腦前額葉BDNF及NGF表達(dá)情況A：Western blot法；B：RT-PCR法；1：假手術(shù)組；2：模型組；3：低劑量丙泊酚組；4：高劑量丙泊酚組；5：陽性對(duì)照組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.3 HE染色觀察結(jié)果圖3顯示，假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞分布均勻，且基本無壞死細(xì)胞；模型組大鼠缺氧模型組細(xì)胞分布散亂，且數(shù)量缺失明顯增多，壞死細(xì)胞較多；低劑量丙泊酚組有較多的壞死細(xì)胞且細(xì)胞分布較為散亂；高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞分布較為均勻，且壞死細(xì)胞均較少。

圖3 HE染色觀察各組大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元病理學(xué)變化結(jié)果 HE×400A：假手術(shù)組；B：模型組；C：低劑量丙泊酚組；D：高劑量丙泊酚組；E：陽性對(duì)照組

2.4 大鼠血清MDA、SOD、LDH的含量水平檢測(cè)結(jié)果圖4顯示，相比假手術(shù)組，模型組大鼠血清MDA、LDH含量水平升高，SOD含量水平降低(P<0.05)；相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠MDA、LDH含量水平降低，SOD含量水平升高(P<0.05)。

圖4 大鼠血清MDA、SOD、LDH的含量水平檢測(cè)結(jié)果A：MDA；B：SOD；C：LDH；1: 假手術(shù)組；2：模型組；3:低劑量丙泊酚組；4: 高劑量丙泊酚組；5：陽性對(duì)照組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.5 ERK1/2和NF-κB p65的磷酸化情況結(jié)果圖5顯示，相比假手術(shù)組，模型組大鼠總ERK1/2、p65蛋白表達(dá)無差異(P>0.05)；相比假手術(shù)組，模型組大鼠p- ERK1/2、p- p65蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠總ERK1/2、p65蛋白表達(dá)無差異(P>0.05)；相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠p- ERK1/2、p- p65蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。

圖5 ERK1/2和NF-κB p65的磷酸化情況結(jié)果A：Western blot法檢測(cè)ERK1/2蛋白表達(dá)及其磷酸化結(jié)果；B:Western blot法檢測(cè)NF-κB p65的磷酸化結(jié)果；1: 假手術(shù)組；2：模型組；3:低劑量丙泊酚組；4: 高劑量丙泊酚組；5：陽性對(duì)照組；與假手術(shù)組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

神經(jīng)功能評(píng)分是CI/R損傷的重要指標(biāo)之一。神經(jīng)功能評(píng)分較高說明大鼠受到缺血再灌注損傷較為嚴(yán)重。腦部缺血再灌注后由于腦組織代謝產(chǎn)物的積聚使得毛細(xì)血管通透性增加，并破壞血腦屏障，導(dǎo)致血漿蛋白和水分外溢，增加腦細(xì)胞外液引起水腫引起腦含水量增加。本研究顯示：相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、姿勢(shì)反射評(píng)分，腦梗死率、腦含水率及腦指數(shù)降低。說明使用丙泊酚處理后大鼠腦組織得到了有效的保護(hù)。這可能是因?yàn)楸捶涌梢杂行Ы档痛笫竽X組織缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。薛青 等[10]研究表明：丙泊酚可以有效保護(hù)大鼠腦組織缺血再灌注后的損傷，本研究得出的結(jié)論與之一致。

BDNF是神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的特異蛋白分子，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。本研究表明，相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠BDNF、NGF表達(dá)降低。說明大鼠腦組織受損程度得到了的改善。缺血再灌注損傷是由多種機(jī)制交互式作用、相互影響導(dǎo)致的。近年來蘇振宇 等[11]研究表明：缺血再灌注損傷與SOD、MDA及LDH密切相關(guān)。MDA會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一系列降解產(chǎn)物會(huì)引起細(xì)胞代謝及功能障礙，可反映細(xì)胞氧化損傷的程度，細(xì)胞內(nèi)氧化程度越高，MDA含量水平越高。SOD具有抗氧化性，是經(jīng)典的抗氧化酶之一，可以有效清除活性氧。機(jī)體內(nèi)SOD水平越高說明機(jī)體清除活性氧的能力越強(qiáng)，當(dāng)腦組織損傷時(shí)其含量會(huì)降低。LDH是細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，只有當(dāng)細(xì)胞損傷才會(huì)由胞內(nèi)釋放到胞外。本研究顯示，相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠MDA、LDH含量水平降低，SOD含量水平升高。說明大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激受到了的抑制，降低了大鼠腦細(xì)胞的損傷，阻止了LDH等進(jìn)入大鼠血液。李昊 等[12]研究表明：丙泊酚可以有效保護(hù)大鼠腦組織缺血后的損傷，本研究得出的結(jié)論與之一致。

ERK1/2是MAPK家族重要成員之一，ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在受到外界刺激激活后會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及抑制凋亡并降低組織的炎癥反應(yīng)發(fā)生。NF-κB是Rel蛋白家族重要成員之一，其中p65為最常見的異源二聚體，在缺血性腦損傷中具有重要作用[13]。P65磷酸化后會(huì)進(jìn)參與細(xì)胞程序化死亡并進(jìn)一步參與體內(nèi)的炎癥和免疫反應(yīng)。本研究表明：相比模型組，低劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組和陽性對(duì)照組大鼠p-ERK1/2、p-p65蛋白表達(dá)降低。說明使用丙泊酚處理后，ERK1/2信號(hào)通路及p65的磷酸化受到了的抑制，這可能與丙泊酚具有保護(hù)線粒體和清除自由基的特性并制中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸的釋放相關(guān)。雷亞娟 等[14]研究表明：丙泊酚可以通過下調(diào)大鼠NF- κB信號(hào)通路表達(dá)實(shí)現(xiàn)保護(hù)缺血再灌注損傷，本研究得出的結(jié)論與之一致。