李莎 洪艷 韓笑 趙龍山 王洋

【摘 要】：目的：分離并篩選漢桃葉鎮(zhèn)痛的藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，為漢桃葉和以漢桃葉為主藥材的制劑的質(zhì)量控制方法建立和技術(shù)改造升級(jí)提供依據(jù)。方法：采用不同溶劑對(duì)漢桃葉進(jìn)行提取，后采用大孔吸附樹(shù)脂法對(duì)漢桃葉提取物進(jìn)行分離，獲得A組分（水洗脫部位）、B組分（10%-30%乙醇洗脫部位）、C組分（50%-75%乙醇洗脫部位）和D組分（有機(jī)酸部位）。通過(guò)熱板實(shí)驗(yàn)對(duì)漢桃葉總提物和四個(gè)分離部位的活性進(jìn)行測(cè)試，篩選藥效部位。結(jié)果：A、B、C組分均表現(xiàn)出了鎮(zhèn)痛活性，其中A組分的鎮(zhèn)痛活性較其他兩組更穩(wěn)定，而C組分活性較B組分更強(qiáng)。通過(guò)進(jìn)一步的成分分析，得出A組分多為單糖和多糖類物質(zhì)，B組分含有大量黃酮和皂苷類物質(zhì)，C組分含有大量的皂苷類物質(zhì)。結(jié)論：漢桃葉中鎮(zhèn)痛活性與漢桃葉單糖和多糖關(guān)系更密切，與皂苷類物質(zhì)含量也有一定相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】漢桃葉;鎮(zhèn)痛;藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

【中圖分類號(hào)】R282.5【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1672-3783（2020）07-21--01

漢桃葉為五加科植物白花鵝掌柴（ScheffierakwangsiensisMerr.exLi）的根或莖、葉，又名廣西鵝掌柴，產(chǎn)于貴州[1]。漢桃葉具有祛風(fēng)止痛，舒筋活絡(luò)之功效。用于治療三叉神經(jīng)痛，坐骨神經(jīng)痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛[2]，目前被做成多種中藥制劑上市，如漢桃葉膠囊，漢桃葉片等，應(yīng)用較廣[2]。目前漢桃葉化學(xué)成分中有機(jī)酸類成分被認(rèn)是藥效作用成分[3-5]。為進(jìn)一步研究漢桃葉鎮(zhèn)痛活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本論文利用層析技術(shù)對(duì)漢桃葉進(jìn)行分離得到不同極性部位，并采用薄層色譜法和紫外分光光度法對(duì)漢桃葉不同部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析，最終確定漢桃葉鎮(zhèn)痛活性的藥效活性成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AL-104電子分析天平（德國(guó)梅特勒公司）;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;紫外分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

齊墩果酸（99.4%），蘆?。?9.4%）由深圳卓越生物科技有限公司提供;吲哚美辛由大連美羅藥業(yè)提供;香草醛（99%）購(gòu)自天津大茂化學(xué)有限公司。生理鹽水和乙醇購(gòu)自沈陽(yáng)禹王有限公司。HP20大孔樹(shù)脂（批號(hào)7G504）購(gòu)自日本日立公司，101*7陰離子交換樹(shù)脂，201*7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂購(gòu)自寧波爭(zhēng)光樹(shù)脂廠。薄層層析板購(gòu)自青島海洋化工廠。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)KM種小鼠，18-22g，雌性由沈陽(yáng)藥科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 漢桃葉不同部位的富集

取漢桃葉藥材1kg，用70%乙醇提取兩次，過(guò)濾，回收醇提液，藥渣干燥，后按照藥典中水提醇沉方法再次提取藥渣，得到水提液。將醇提液與水提液合并，濃縮干燥得到浸膏粉末100g。取漢桃葉浸膏粉末65g，將其完全溶解于300ml的去離子水中，上樣至Hp20大孔吸附樹(shù)脂，依次用3倍柱體積的水、10%、20%、30%、50%、75%和95%乙醇依次洗脫，50℃減壓濃縮至干浸膏，后凍干至干燥粉末，得到水洗脫部位（20.8g，32%），10%乙醇洗脫部位（3.2g，4.9%），20%乙醇洗脫部位（5.5g，8.4%），30%乙醇洗脫部位（4.2g，6.4%），50%乙醇洗脫部位（10.3g，15.8%），75%乙醇洗脫部位（2.3g，3.5%），95%乙醇洗脫部位（0.67，1.0%）。通過(guò)薄層分析，將成分相似的部位合并，得到A組分（水洗脫部位，32%）、B組分（10%，20%，30%乙醇洗脫部位，19.9%）、C組分（50%，70%乙醇洗脫部位，19.3%）。

取漢桃葉浸膏粉35g溶解于200ml去離子水中，將浸膏溶液上樣于201*7陰離子交換樹(shù)脂上，收集1%HCl的洗脫液，后減壓蒸餾濃縮，得到初步有機(jī)酸富集部位浸膏液[3]。后取001*7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂800ml，將其進(jìn)行溶脹、活化。將富集到的有機(jī)酸浸膏液100ml上樣，用4倍柱體積去離子水進(jìn)行洗脫，回收洗脫液，減壓濃縮至濃浸膏，后置于凍干機(jī)上去除水分，得到D組分有機(jī)酸類富集組分（7.2g，20%）。

2.2 漢桃葉的鎮(zhèn)痛的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 給藥劑量確定

設(shè)定小鼠灌胃給藥體積為10mL/kg，在已有論文和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定漢桃葉總提物的實(shí)驗(yàn)劑量為5g/kg/d。為提高藥效實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的顯著性，四個(gè)組分的給藥劑量之和是在總提物的1.8倍的實(shí)驗(yàn)劑量（9g/kg/d）的基礎(chǔ)上，按照此部位占總提物的含量百分比進(jìn)行換算得到的。這種換算方式在考察不同部位各自的藥效活性的同時(shí)，同時(shí)考慮了不同化合物的在總提物中的質(zhì)量占比，與用藥實(shí)際情況更加符合。最終幾個(gè)部位給藥量分別為2.8g/kg/d（A組分），1.8g/kg/d（B組分），1.7g/kg/d（C組分），2.8g/kg/d（D組分）。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

將雌性小鼠投入至熱板致痛儀中，將熱板致痛儀溫度控制在（55±0.5）℃，至出現(xiàn)舔后足的時(shí)間（s）作為該鼠的痛閾值，小于5s或大于30s或跳躍者棄之不用。篩選合格雌性小鼠，重復(fù)測(cè)其正常痛閾值，取兩次正常痛閾的平均值作為該鼠給藥前痛閾值。隨機(jī)分組，每組12只。

陰性對(duì)照組小鼠給生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給吲哚美辛20mg/kg/d，漢桃葉A、B、C、D組每組每天按照小鼠體重以劑量0.1mL/10g灌胃給藥1次，連續(xù)7d。

測(cè)定小鼠給藥后第30、60、90、120min的痛閾值。如果痛閾超過(guò)60s，按60s記錄，并計(jì)算痛閾提高率。痛閾提高率（%）=（給藥后痛閾值-給藥前痛閾值）/給藥前痛閾值×100。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

漢桃葉總體物在熱板鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中，四個(gè)時(shí)間點(diǎn)30min、60min、90min、120min與給藥前相比，均表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛活性，痛閾值提高百分比分別為30%、82%、80%、50%（表1），效果弱于陽(yáng)性藥吲哚美辛組。

在四個(gè)組分的熱板鎮(zhèn)痛試驗(yàn)中，除D組未表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛活性，其余三組均有鎮(zhèn)痛活性。其中，B組只在90min時(shí)表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛活性，痛閾提高百分比為77.84%;C組鎮(zhèn)痛活性優(yōu)于B組，在90min和120min均表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛活性，痛閾提高百分比為116.23%和84.93%，且優(yōu)于該時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性藥組吲哚美辛90min（88.27%）和120min（58.93%）。A組在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)30min、60min、90min、120min與給藥前相比，均表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛活性，痛閾值提高百分比分別為32.95%、46.82%、47.98%、60.12%，抗炎鎮(zhèn)痛活性弱于陽(yáng)性藥組，但在30min和60min時(shí)間點(diǎn)優(yōu)于C組。

2.3 藥效部位成分分析

2.3.1 薄層鑒別實(shí)驗(yàn)

2.3.1.1 黃酮類成分薄層鑒別

將水、10%、20%、30%，50%、75%和95%洗脫部位和有機(jī)酸部位用各自的洗脫溶劑溶解，總浸膏粉末和有機(jī)酸部位分別用20%甲醇和水溶解，依次于薄層板上點(diǎn)樣。以二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（8：5：0.5）為展開(kāi)劑，三氯化鋁-乙醇溶液為顯色劑，在紫外波長(zhǎng)365nm下進(jìn)行觀察對(duì)漢桃葉提取物各部位進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。

此反為鑒別黃酮類成分的常用方法，通過(guò)噴灑三氯化鋁顯色劑，黃酮類成分與三氯化鋁進(jìn)行絡(luò)合，呈現(xiàn)黃色或藍(lán)色條帶。結(jié)果如圖1所示，在總提取物、10%，20%，30%，50%，75%乙醇洗脫部位均出現(xiàn)明顯的熒光條帶，說(shuō)明總提取物，藥效試驗(yàn)B和C組分中中含有黃酮類成分。

2.3.1.2 皂苷類成分薄層鑒別

將水、10%、20%、30%，50%、75%和95%洗脫部位和有機(jī)酸部位用各自的洗脫溶劑溶解，總浸膏粉末和有機(jī)酸部位分別用20%甲醇和水溶解，依次于薄層板上點(diǎn)樣。以二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（8：5：0.5）為展開(kāi)劑，醋酐-濃硫酸溶液為顯色劑，對(duì)漢桃葉提取物各部位進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。

醋酐-濃硫酸溶液為三萜和甾體皂苷的顯色劑，三萜皂苷會(huì)在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紅、藍(lán)、紫等顏色的顯色但不出現(xiàn)綠色，甾體皂苷會(huì)經(jīng)過(guò)一系列的顏色變化，最終顯綠色。如薄層色譜圖2可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)樹(shù)脂的分段，不同極性的化合物被成功分離到不同的富集部位?？偨?、10%，20%，30%，50%，75%乙醇洗脫部位分別出現(xiàn)了紫色的顯色反應(yīng)條帶，可知藥效試驗(yàn)中總提取物，B組分和C組分均含有大量的皂苷。通過(guò)顏色可判斷皂苷類型主要為三萜皂苷。同時(shí)，根據(jù)顯色反應(yīng)的條帶深淺程度，可判斷C組分含有皂苷含量較多。

2.3.2 漢桃葉總浸膏和各富集部位的總黃酮和總皂苷含量測(cè)定

在2015版藥典中，漢桃葉片是應(yīng)用紫外光度法，以蘆丁為對(duì)照品測(cè)總黃酮的含量來(lái)進(jìn)行質(zhì)量控制，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用藥典中的總黃酮的測(cè)定方法對(duì)富集到的各個(gè)部位的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)已有的文獻(xiàn)報(bào)道和以上的薄層鑒別實(shí)驗(yàn)我們知道漢桃葉含有大量的三萜皂苷類成分。有報(bào)道此類成分具有較好的鎮(zhèn)痛的藥效[8-10]，因此我們以齊墩果酸為對(duì)照品，測(cè)各部位中總皂苷類成分的含量。用以上兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果區(qū)別這兩類成分在各部位中的含量差異。

按中國(guó)藥典中黃酮總量的檢測(cè)方法進(jìn)行操作，得到建立標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12.766x+0.0071。后取各樣品約0.16g對(duì)各部位中進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表1。按相關(guān)文獻(xiàn)中的方法繪制齊墩果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，后對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。將樣品各稱取10mg溶解于5ml的甲醇中，得到5ml樣品液。按上述齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備流程，對(duì)樣品液進(jìn)行測(cè)定，將得到的數(shù)值代入線性回歸方程，計(jì)算出樣品中總皂苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表1所示，在富集到各部位中，10%，20%，30%的乙醇洗脫部位（B組分）中含有黃酮量和皂苷含量最多。而水洗脫部位中黃酮含量約為4%，皂苷含量較少，推測(cè)多為單糖和多糖類物質(zhì)。在B組分（50%，75%乙醇洗脫部位）中，皂苷和黃酮含量均小于4%。有機(jī)酸部位紫光吸光度示數(shù)過(guò)低，說(shuō)明皂苷和黃酮含量極低。

3 結(jié)果與討論

結(jié)合以上化學(xué)組分分析和藥效活性實(shí)驗(yàn)，可知在漢桃葉的鎮(zhèn)痛藥效活性中，A、B、C三個(gè)組分均表現(xiàn)出了鎮(zhèn)痛活性，其中A組分的鎮(zhèn)痛活性較其他兩組更穩(wěn)定，而C組分活性優(yōu)于B組分。這幾個(gè)部位中，A組分含有多為單糖和多糖類物質(zhì)，B組分含有大量黃酮和皂苷類物質(zhì)，C組分含有皂苷類物質(zhì)。因此我們推斷，漢桃葉中鎮(zhèn)痛活性應(yīng)該與漢桃葉單糖和多糖關(guān)系更密切，與皂苷類和黃酮類物質(zhì)含量也有一定相關(guān)。因此在后續(xù)得質(zhì)量控制中，可以加強(qiáng)這幾類特別是糖類物質(zhì)的監(jiān)測(cè)。

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