李 雁，王曉喜，畢宏濤，陳 琦，魏立新，尚 靖，3*

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所 青海省藏藥藥理學(xué)與安全性評價研究重點實驗室，青海 西寧 810000；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 210000）

功能性消化不良（Functional dyspepsia，F(xiàn)D）是常見的功能性胃腸疾病之一，其全球發(fā)病率相差較大，據(jù)調(diào)查，亞洲人群患病率在8%～23%［1］，而國內(nèi)FD 發(fā)病率在18%～45%，占到消化門診的20%～50%［2-3］。由于該病反復(fù)發(fā)作，且目前臨床使用的西藥大多伴隨嚴重的消化道和神經(jīng)系統(tǒng)方面的副作用，所以從傳統(tǒng)醫(yī)藥中探索其新的治療方案已成為當前該疾病治療藥物的研究熱點［4-8］。臨床研究表明，藏藥經(jīng)典制劑當佐治療功能性消化不良的有效率達到93.3%，且療效優(yōu)于其組成方劑安置精華散［9-12］。但是迄今為止，當佐治療功能性消化不良的藥理機制仍有待研究。本研究旨在通過測定功能性消化不良模型大鼠胃腸激素血漿胃動素（MTL），血清胃泌素（GAS）以及胃竇一氧化氮（NO）水平變化，從胃腸激素水平變化方面，探究當佐治療功能性消化不良的作用機理。

1 材料

1.1 藥物 安置精華散［石榴籽、肉桂、白豆蔻、篳菝、紅花五味藥按照《衛(wèi)生部藥品標準》1995 年版（藏藥第一冊）組方而成［13-14］；藥材購自青海省富康醫(yī)藥有限責任公司，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所杜玉枝研究員鑒定］；佐太（西藏藏醫(yī)院，批號2012）；當佐（由質(zhì)量比10%佐太和90% 安置精華散混合而成）；多潘立酮片（國藥準字H20044163，批號170702，海南亞洲制藥股份有限公司）。

1.2 動物 SPF 級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（220±50）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)提供，使用許可證號SYXK（甘）2015-0005，飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，光照時間12 h；動物實驗經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所實驗動物倫理委員會批準。

1.3 試劑 胃泌素、胃動素ELISA 試劑盒（上海將來實業(yè)股份有限公司，批號201808）；NO 測定試劑盒（南京建成生物科技有限責任公司，批號20180823）；考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒（南京建成生物科技有限責任公司，批號20180719）；甲基橙（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20140102）；碳酸氫鈉（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號20130320）；水合氯醛（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號20180518）；生理鹽水（國藥準字H61020014，批號1708146B，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司）；PBS（博士德生物工程有限公司，批號09B16B30）。

1.4 儀器 酶標儀（Enspire SJZX-40，新加坡PerkinElmer公司）；離心機（3-18ks，德國Sigma 公司）；高通量組織勻漿研磨器（Scientz-48，寧波新芝生物科技股份有限公司）；電子天平［AL104，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；722 分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 造模及分組 SD 雄性大鼠72 只，稱定體質(zhì)量后隨機分為空白組、模型組、多潘立酮組、安置精華散組、佐太組、當佐組，除空白組外，其余各組按文獻所述稍加改良后造模［15］，在夾尾刺激同時單日正常飲食，雙日禁食。造模及給藥處理如下表所示［16］，各藥物采用2%淀粉配置成相應(yīng)濃度的混懸液，給藥體積為10 mL/kg，每日1 次，連續(xù)給藥2 周。

表1 實驗動物分組及給藥情況

2.2 體質(zhì)量及進食量的測定 分別于造模前、造模結(jié)束（給藥前）、給藥結(jié)束時稱定質(zhì)量，得到各組大鼠體質(zhì)量變化量。不規(guī)則飲食即單日正常飲食，雙日禁食，在單日上午9：30 給予各組動物固定量的鼠食（固體，天平稱重），至次日上午9：30 測定其余量，兩者差值即該組大鼠該日進食量。

2.3 胃排空測定（胃內(nèi)甲基橙含有率）參考文獻［17-18］，各組大鼠于實驗結(jié)束后禁食不禁水12 h，并給每只大鼠灌胃3 mL 0.1%甲基橙溶液，30 min 后5%水合氯醛麻醉大鼠，心臟采血；并迅速打開腹腔取下整胃，沿胃大彎剪開用并5 mL 生理鹽水充分沖洗胃內(nèi)容物于試管中，用5%碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至6～6.5 后定容至10 mL，3 000 r/min離心10 min 取上清液；另以3 mL 0.1%甲基橙溶液加7 mL生理鹽水混勻，離心取上清液作為標準液；420 nm 處測定吸光度值（OD），并按照下列公式計算出各組大鼠胃中甲基橙殘留率，胃中甲基橙含有率＝（OD胃中甲基橙/OD標準液甲基橙）×100%。

2.4 胃動素（MTL）、胃泌素（GAS）水平測定 ①血清樣本處理，采血得到血液后靜置使其自然凝固，在4 ℃下，3 000 r/min 離心20 min，收集上清即為待測血清；②血漿樣本處理，選擇乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）作為抗凝劑，將血液置于含有抗凝劑的采血管中混勻，并在4 ℃下，3 000 r/min 離心20 min，收集上清即為待測血漿。MTL、GAS 水平測定采用ELISA 法，具體步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.5 胃竇NO 水平測定 將胃內(nèi)容物充分清洗干凈之后，自大鼠胃幽門括約肌處取得適量胃竇部組織，并用蒸餾水沖洗干凈后用濾紙吸干多余水分后準確稱重，按1∶9（質(zhì)量/體積）的比例，加入PBS，冰水浴條件下破碎組織得到勻漿液，4 000 r/min 離心15 min，取上清液。蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍法，以硝酸還原酶法測定組織勻漿上清液的NO 水平，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 21.0 進行數(shù)據(jù)處理，Graphpad prism 6.0 軟件作圖。數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 動物健康狀態(tài)變化 造模之前，各組大鼠活潑好動、毛發(fā)整潔有光澤，精神狀態(tài)上佳。造模后，空白組大鼠狀態(tài)未見異常；各造模組大鼠從起初打斗劇烈，容易暴怒逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榇蚨窚p弱，對環(huán)境變化敏感，易受驚，抱團蜷縮，消極對待打斗甚至停止掙扎，糞便增多，濕軟并發(fā)出惡臭，大鼠肛周污穢，進食量明顯增加；給藥后，空白組大鼠狀態(tài)仍未見異常，基本與實驗前保持一致；模型組大鼠精神狀態(tài)差，反應(yīng)遲鈍且暴躁易怒，多潘立酮，當佐和安置精華散組大鼠相比模型組，以上狀態(tài)改善明顯，打斗稍變劇烈，大鼠亦稍加活潑好動，抵抗增加，精神回佳，糞便狀態(tài)恢復(fù)干燥、惡臭消失，進食量恢復(fù)正常；佐太組大鼠相比模型對照組狀態(tài)未見明顯改善。

3.2 體質(zhì)量增長量 實驗前各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異，實驗結(jié)束后各組大鼠體質(zhì)量變化如圖1 所示，空白組大鼠體質(zhì)量增加，模型組大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)負增長（P＜0.01）；相比模型組，多潘立酮、當佐和佐太組大鼠體質(zhì)量增長，增長量分別為41.93%、60.79%、34.04%（P＜0.05）；而安置精華散組大鼠在給藥2 周后，體質(zhì)量略有增加（7.81%），與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量增長量（，n=12）

3.3 各組胃甲基橙含有率（胃排空速度）如圖2 所示，與空白組相比，模型組大鼠胃內(nèi)甲基橙含有率降低12.00%（P＜0.05），胃排空速度減慢；多潘立酮、當佐、安置精華散和佐太組大鼠胃內(nèi)甲基橙含有率相比模型組分別提高24.37%、23.42%、19.17%和6.20%（P＜0.05），即胃排空速度明顯加快。

圖2 各組大鼠胃內(nèi)甲基橙含有率（，n=12）

3.4 各組血漿胃動素（MTL）水平 如圖3 所示，給藥后，模型組大鼠MTL 水平與空白組相比，降低9.98%（P＜0.01）；與模型組相比，多潘立酮組大鼠血漿MTL 水平增加9.70%（P＜0.01），恢復(fù)至正常水平；當佐、安置精華散和佐太亦增加大鼠血漿MTL 水平，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，增加量分別為7.33%、4.33%、4.38%。

圖3 各組大鼠血漿胃動素（MTL）水平（，n=12）

3.5 各組血清胃泌素（GAS）水平 GAS 是一種與胃酸分泌有關(guān)的胃腸激素，其水平的變化與胃腸功能緊密相關(guān)。如圖4 所示，給藥后，相比空白組，模型組大鼠血清GAS水平上升13.59%（P＜0.01）；當佐、安置精華散和佐太作用與多潘立酮作用相似，血清GAS 水平都下降（P＜0.01），當佐組下降45.49%，安置精華散組下降48.04%，佐太組下降38.47%。

圖4 各組大鼠血清胃泌素水平（，n=12）

3.6 各組胃竇NO 水平 NO 是大量存在于胃腸道的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對胃腸道運動具有抑制作用。如圖5 所示，給藥后，相比空白組，模型組大鼠胃竇NO 水平增加32.69%（P＜0.01）；與模型組相比，多潘立酮組與當佐組大鼠胃竇組織NO 水平分別降低37.42% 和26.93%（P＜0.01）；安置精華散和佐太組大鼠胃竇NO 水平也分別降低19.62%和11.43%，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 各組大鼠胃竇NO 水平（，n=12）

4 討論

當佐是藏醫(yī)臨床常用傳統(tǒng)復(fù)方制劑，由安置精華散和佐太按比例配伍而成，其中，安置精華散是出自《四部醫(yī)典》“泄瀉癥治療”中的藏藥經(jīng)典方劑［13］，由石榴籽、肉桂、白豆蔻、蓽菝、紅花五味藥組成［14］。佐太是珍寶類藏藥中的核心成分，常作為藥物佐劑?；谝陨吓湮榻M成，當佐具有溫胃益火、化滯除濕、溫通脈道、保肝健胃的功效，主要用于治療消化不良、寒性腹瀉、慢性腸胃炎等病癥［9］。

作為藏醫(yī)臨床常用于治療胃腸疾病的經(jīng)典名方，當佐除臨床研究證明對功能性消化不良具有良好治療作用之外［10］，還有研究證明，當佐能夠調(diào)節(jié)FD 肝郁脾虛大鼠的胃腸動力，降低胃內(nèi)殘留率，治療應(yīng)激誘導(dǎo)的功能性消化不良［16］。本研究利用夾尾刺激和不規(guī)則飲食聯(lián)用復(fù)合因素建立功能性消化不良大鼠模型，選擇MTL、GAS、NO 作為檢測指標，初步探究當佐對該模型大鼠胃腸激素水平的影響。

其中，MTL 作為一種在多數(shù)哺乳動物上消化道表達的胃腸激素，在消化期間，呈周期性釋放，主要作用于平滑肌上的胃動素受體，引起胃和上部小腸產(chǎn)生消化期綜合肌電Ⅲ相并誘發(fā)胃強烈收縮和小腸明顯的分節(jié)運動，導(dǎo)致平滑肌收縮，加速胃排空和小腸傳輸［19-20］。本研究中，模型組大鼠MTL 水平低于空白組，臨床等效劑量下的當佐能夠增加FD 大鼠血漿MTL 水平，增幅為7.33%，而安置精華散和佐太使FD 大鼠MTL 水平增幅分別為4.33%和4.38%，此結(jié)果表明當佐，安置精華散和佐太能增強FD 模型大鼠胃收縮，加速胃排空，改善FD 大鼠胃腸動力障礙，其中當佐作用效果最優(yōu)。

GAS 是有促進胃酸分泌、增加胃竇收縮、加快胃排空的功能的一種胃腸激素，有研究發(fā)現(xiàn)不同程度胃排空障礙患者血清胃泌素升高，血清胃泌素也可以提示患者胃黏膜的狀態(tài)，在胃腸道疾病狀態(tài)的診斷中具有重要意義［22-22］。本研究中，模型組大鼠GAS 水平低于空白組，而給藥后，當佐，安置精華散和佐太組大鼠GAS 明顯降低（45.49%、48.04%、38.47%），說明給藥后，各組大鼠胃腸動力恢復(fù)，胃竇收縮以及胃排空速度加快，F(xiàn)D 大鼠GAS 分泌量隨之減少。

NO 是廣泛存在于胃腸道的非膽堿能非腎上腺素能神經(jīng)遞質(zhì)，是對胃腸道運動具有抑制作用且含量較高的神經(jīng)遞質(zhì)，主要介導(dǎo)胃容受性舒張的反射活動，還具有對抗乙酰膽堿和MTL 對胃的收縮作用，影響胃的縮張，蠕動和排空［23-24］，其水平過高過低都會導(dǎo)致胃腸動力障礙。本研究中，模型組大鼠胃竇NO 高于空白組，而當佐能使FD 大鼠胃竇NO 水平降低26.93%，安置精華散與佐太分別降低19.62%和11.43%，此結(jié)果表明，當佐，安置精華散和佐太能通過減少NO 水平減弱MTL 對胃收縮的抵抗，加速大鼠胃腸平滑肌收縮，增加胃蠕動速度，提高胃腸動力，增加胃排空速度，其中當佐作用效果最優(yōu)。

本研究通過對FD 大鼠胃動素、胃泌素、一氧化氮等指標的檢測，對大鼠體質(zhì)量、行為以及胃內(nèi)甲基橙含有率的研究，發(fā)現(xiàn)對于夾尾刺激聯(lián)合不規(guī)則飲食造成的功能性消化不良病癥的治療，臨床等效劑量下，當佐作用效果最佳，與陽性藥物多潘立酮無顯著差別，且優(yōu)于安置精華散和佐太。研究結(jié)果表明當佐及其配伍組成安置精華散治療功能性消化不良的作用機制可能是增加大鼠MTL、減少GAS 和NO 等胃腸激素含量，從而引起大鼠胃收縮，蠕動和排空速度增加，最終改善大鼠胃腸動力障礙。其確切的分子機制，還有待深入探究。