許江濤 ，勞梓釗，張麗娟，廖小紅，閻 雪，吳依娜，李得堂*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東 中山 528400；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

變應(yīng)性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）為機體由變應(yīng)原所引起的由免疫球蛋白E 介導(dǎo)的過敏性疾病。近十年來，發(fā)病率呈明顯上升的趨勢［1］，疾病發(fā)展到后期，較多患者往往會誘發(fā)為過敏性哮喘。目前AR 的發(fā)病機制尚未完全明確，以往研究顯示，AR 的發(fā)病機制主要是由Th1/Th2 免疫的失衡所引起［2］，隨著深入研究發(fā)現(xiàn)，AR 的發(fā)病過程中還涉及到Th17/Treg 細胞之間的失衡［3］

AR 屬于中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇，臨床常分為肺氣虛型、脾氣虛型等，其中肺氣虛型較為常見，肺氣虛，衛(wèi)表不固，外邪乘虛而入所致。故臨床上常用經(jīng)方玉屏風(fēng)散為基礎(chǔ)治療AR，顯示出較好的臨床療效。玉屏風(fēng)散出自《丹溪心法》，是益氣固表的經(jīng)典名方。為深入探討玉屏風(fēng)對AR 大鼠Th17/Treg平衡及相關(guān)細胞因子的調(diào)控作用，本課題組采用卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)建立AR 大鼠模型，觀察玉屏風(fēng)對AR 大鼠Th17/Treg 平衡及相關(guān)細胞因子的影響，進一步研究玉屏風(fēng)治療AR 的作用機制。

1 材料

1.1 動物 40 只SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心［許可證號SXCK（粵）2018-0034］。實驗于廣州中醫(yī)藥大學(xué)的ABSL-2 實驗室飼養(yǎng)［實驗室備案書編號為粵廣動實備GZL0 004 號］完成，本實驗開展經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 玉屏風(fēng)顆粒組方藥材為炙黃芪、防風(fēng)、炒白術(shù)。取上述3 味藥材，先加8 倍量水提取1.5 h，過濾，藥渣再加6 倍量水提取1 h，過濾，合并2 次提取液，濾液減壓濃縮至相對密度為1.15～1.20 稠膏，與適量蔗糖粉、糊精混勻，沸騰噴霧制成顆粒，干燥，整粒，分裝。每克顆粒相當(dāng)于1 g生藥量，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供（批號20180301）；氯雷他定片（拜耳醫(yī)藥上海有限公司，批號JS07620）；卵清蛋白（OVA，廣州捷倍斯生物科技有限公司，批號1706GYD005）；Foxp3、RORγt、β-actin 引物（擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）；TGF-β1 試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號144463021）；β-actin 抗體（美國Gene Tex 公司，批號GTX109639）；Foxp3 抗體（美國Thermo Fisher Scientific 公司，批號14577382）；RORγt 抗體（美國Santa Cruz 公司，批號sc-293150）；IL-17 試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，批號R190822-170a）。

1.3 儀器 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；蛋白印跡儀（美國Protein Simple 公司）。

2 方法

2.1 造模 大鼠隨機分為正常組、模型組。參考文獻方法造模［4］，共兩個階段，基礎(chǔ)致敏［致敏液為0.3 mg OVA、30 mg A1（OH）3，溶于1 mL 生理鹽水］，腹腔注射隔天1 次，共7 次，以及局部激發(fā)（致敏液為5%OVA 溶液），連續(xù)14 d滴鼻（100 μL）。

2.2 分組及給藥 在完成基礎(chǔ)致敏階段后，將模型組大鼠隨機分為模型組、氯雷他定組（0.9 mg/kg）［5］、玉屏風(fēng)顆粒組（12、6 g/kg）［6-7］。在第二激發(fā)階段期間，藥物組每次局部激發(fā)前30 min灌胃給藥，另外兩組以生理鹽水灌胃替代。

2.3 AR 行為學(xué)評分 造模第27 天末次鼻腔激發(fā)后30 min 內(nèi)，觀察每組大鼠鼻部過敏癥狀（鼻癢、噴嚏、流涕等表現(xiàn)）為主的行為學(xué)并記錄評分，評分標準參考表1。指標評分后累計總分大于5分，即判為造模成功［8］。

表1 AR 行為學(xué)評分標準Tab.1 AR behavioral scoring criteria

2.4 鼻黏膜組織病理學(xué)觀察 實驗結(jié)束當(dāng)天，每組隨機選取2 只，將大鼠頸椎脫臼處死后，收集鼻黏膜組織用于制片，分別用HE 和AB-PAS 染色，顯微鏡下觀察鼻黏膜組織病理學(xué)改變。

2.5 大鼠血清中IL-17、TGF-β1 水平的檢測 實驗結(jié)束當(dāng)天，使用水合氯醛麻醉大鼠，首先通過眼底靜脈叢取血，離心收集血清，儲存于-80 ℃。參照試劑盒說明書，按步驟檢測大鼠血清中IL-17、TGF-β1 水平。

2.6 RT-PCR 法測定大鼠鼻黏膜組織中Foxp3、RORγtmRNA 表達 實驗結(jié)束當(dāng)天，將每組剩余大鼠處死取新鮮鼻黏膜組織10 mg，加入TRIzol 裂解液充分研磨，提取總RNA 以及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進行實時熒光PCR 檢測Foxp3、RORγtmRNA 表達。反應(yīng)條件，95 ℃、3 min；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，共40 個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算相關(guān)基因mRNA 的相對表達量。引物序列見表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequences

2.7 大鼠鼻黏膜組織中Foxp3、RORγt 蛋白表達 實驗結(jié)束當(dāng)天，每組隨機選取2 只，將大鼠頸椎脫臼處死后，收集鼻黏膜組織，加入RIPA 裂解液及PMSF，充分裂解提取總蛋白，BCA 法測定蛋白量，進行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入一抗Foxp3（1∶1 000）、RORγt（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，加ECL 化學(xué)發(fā)光劑于蛋白印跡儀成像，用Image J圖像分析軟件對圖像進行分析，計算RORγt/Foxp3蛋白比值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以（）表示；多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗；以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 AR 行為學(xué)總分、打噴嚏次數(shù)、撓鼻次數(shù)的比較 如圖1 顯示，與正常組比較，模型組大鼠撓鼻次數(shù)、打噴嚏次數(shù)和AR 行為學(xué)總分升高（P＜0.05），而且模型組行為學(xué)總分大于5 分，表明此次AR 大鼠模型造模成功。與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組（12、6 g/kg）大鼠撓鼻次數(shù)、打噴嚏次數(shù)和行為學(xué)總分均降低（P＜0.05）。

3.2 玉屏風(fēng)顆粒對AR 大鼠鼻黏膜組織的影響 如圖2～3 顯示，正常組上皮細胞排列整齊、少量炎癥細胞浸潤、上皮層內(nèi)無明顯杯狀細胞化生。模型組黏膜結(jié)構(gòu)不完整、部分纖毛上皮、基底膜脫落、大量炎癥細胞浸潤、上皮層內(nèi)大量杯狀細胞化生，杯狀細胞體積增大且分泌旺盛。玉屏風(fēng)顆粒組（12 g/kg）上皮細胞結(jié)構(gòu)完整、少量炎癥細胞浸潤、杯狀細胞數(shù)量明顯下降。而玉屏風(fēng)顆粒組（6 g/kg）上皮細胞較為完整、炎癥細胞浸潤和杯狀細胞增生情況有輕微改善。

3.3 玉屏風(fēng)顆粒對AR 大鼠血清中IL-17、TGF-β1水平的影響 如圖4 顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清中的IL-17 水平升高，TGF-β1 水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組（12、6 g/kg）大鼠血清中的IL-17 水平降低，TGF-β1 水平升高（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠撓鼻、打噴嚏等行為學(xué)總分的比較（n=8）Fig.1 Comparison of scores of scratching，sneezing and other behavior in each group（n=8）

圖2 各組鼻黏膜組織的HE 染色（×200）Fig.2 HE staining of nasal mucosa in each group（×200）

圖3 各組鼻黏膜組織的AB-PAS 染色（×200）Fig.3 AB-PAS staining of nasal mucosa in each group（×200）

3.4 玉屏風(fēng)顆粒對AR 大鼠鼻黏膜組織中Foxp3、RORγtmRNA 表達的影響 如圖5 顯示，與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織RORγtmRNA 表達升高，F(xiàn)oxp3 mRNA 表達降低（P＜0.05）。與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組（12、6 g/kg）大鼠鼻黏膜組織Foxp3 mRNA 表達升高，RORγt mRNA 表達降低（P＜0.05）。

3.5 玉屏風(fēng)顆粒對AR 大鼠鼻黏膜組織中Foxp3、RORγt 蛋白表達的影響 如圖6 顯示，與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織RORγt/Foxp3 蛋白表達比例升高（P＜0.05）。與模型組比較，玉屏風(fēng)顆粒組（12、6 g/kg）大鼠鼻黏膜組織RORγt/Foxp3蛋白表達比例降低（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠血清中IL-17、TGF-β1 水平（n=8）Fig.4 Serum levels of IL-17，TGF-β1 in rats of each group（n=8）

圖5 各組大鼠鼻黏膜組織中Foxp3、RORγt mRNA 表達（n=4）Fig.5 mRNA expression of Foxp3，RORγt in rats nasal mucosa in each group（n=4）

圖6 各組大鼠鼻黏膜組織中Foxp3、RORγt 的蛋白表達（n=3）Fig.6 The protein expression of Foxp3，RORγt in nasal mucosa of rats in each group（n=3）

4 討論

變應(yīng)性鼻炎發(fā)生過程中不僅涉及Th1/Th2 免疫平衡，還包括Th17/Treg 免疫平衡，隨著對變應(yīng)性鼻炎發(fā)病機制的研究不斷增多，Th17/Treg 免疫平衡為治療AR 的機制研究和臨床治療提供了研究思路。Th17 和Treg 細胞是效應(yīng)T 細胞亞群，分化自CD4+T 細胞。RORγt（Th17 細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子）是Th17 細胞分化的前提［9］，IL-17 是Th17 細胞主要效應(yīng)細胞因子，亦稱為前炎性因子［10］。Treg 細胞具有免疫抑制功能，在維持免疫耐受中發(fā)揮關(guān)鍵作用，F(xiàn)oxp3（Treg 細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子）的表達水平影響Treg 的功能變化［11-12］，TGF-β1（Treg 細胞主要分泌細胞因子）能促進表達Foxp3 的Treg 分化［13］。Th17 和Treg 細胞在功能是相互拮抗的［14］，兩者之間在一定的平衡情況下，才能維持機體免疫狀態(tài)相對穩(wěn)定。Foxp3 和RORγt的平衡被破壞可能會誘導(dǎo)主要由Th17 細胞參與的致炎的T 淋巴細胞反應(yīng)［15］。揭示IL-17、TGF-β1、Foxp3、RORγt 與Th17/Treg 免疫平衡密切相關(guān)。

玉屏風(fēng)散最早出自《醫(yī)方類聚》，后在《丹溪心法》有詳細記載，為中醫(yī)經(jīng)典名方，對多種疾病有較好療效，主要由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三味中藥組成，其中黃芪補脾肺之氣，白術(shù)健脾益氣，防風(fēng)走肌表而散風(fēng)邪，整體發(fā)揮益氣固表，扶正祛邪的功效。AR 屬于中醫(yī)“鼻鼽”范疇，該病的病因多數(shù)為肺氣虛，衛(wèi)表不固，外邪入侵等所致，該病亦屬于過敏性疾病，具有反復(fù)發(fā)作，不易根治的特點，而玉屏風(fēng)在臨床上用于治療AR 患者的效果好，對比西藥治療，具有復(fù)發(fā)率低［16］，毒副作用低，長期療效較為穩(wěn)定的優(yōu)勢，為臨床首選方劑?，F(xiàn)代藥理研究證明，玉屏風(fēng)散能明顯改善AR 大鼠炎性癥狀，具有抗過敏作用［17］。目前尚未有關(guān)于玉屏風(fēng)對AR 大鼠Th17/Treg 平衡及相關(guān)細胞因子影響的研究。

本實驗采用OVA 誘導(dǎo)建立的AR 大鼠模型作為藥效評價模型，較好模擬AR 典型臨床特征［18］。本次實驗結(jié)果顯示，OVA 誘導(dǎo)的AR 大鼠出現(xiàn)明顯的鼻黏膜炎性癥狀，鼻黏膜組織炎性細胞浸潤較多，大量杯狀細胞化生及分泌亢進，黏液分泌增加，含較高含量的黏蛋白，鼻黏膜組織重塑特征明顯；血清中IL-17 水平明顯上升，而TGF-β1 水平明顯降低；鼻黏膜Foxp3 表達明顯下降，而RORγt表達明顯上升；鼻黏膜RORγt/Foxp3 蛋白表達比例明顯升高。提示IL-17、TGF-β1、Foxp3、RORγt表達水平在變應(yīng)性鼻炎的疾病發(fā)展過程具有關(guān)鍵作用，在Th17/Treg 平衡中以Th17 免疫反應(yīng)占優(yōu)勢。玉屏風(fēng)干預(yù)后，可有效緩解AR 大鼠炎性癥狀和鼻黏膜組織炎癥細胞浸潤，減少杯狀細胞化生和黏液分泌，降低血清的IL-17 水平和提高TGF-β1 水平，同時降低鼻黏膜RORγtmRNA 及蛋白水平表達，升高鼻黏膜Foxp3 mRNA 及蛋白水平表達，使Th17/Treg 免疫平衡向Treg 免疫反應(yīng)占優(yōu)趨勢轉(zhuǎn)化，從而調(diào)節(jié)AR 大鼠Th17/Treg 免疫失衡。

綜上所述，玉屏風(fēng)對變應(yīng)性鼻炎大鼠鼻黏膜炎癥癥狀有明顯的緩解作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)Th17/Treg 平衡及相關(guān)細胞因子相關(guān)。