陳向陽 ，穆愛潔，汪蒙蒙，付婕妤，陳永霞，王衛(wèi)東，吳永祥*

（1.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041；2.黃山祁弘韻蛋白桑農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽 黃山 245612；3.黃山峰源生物科技有限公司，安徽 黃山 245600）

蛋白桑Morus albaL.又稱飼料桑，是我國經(jīng)過長期選育、改良、優(yōu)化的新型品種，具有區(qū)域適應(yīng)性和抗逆性強、產(chǎn)量高等優(yōu)點，已在許多地區(qū)得到大力推廣［1］。桑葉主要化學(xué)成分包括多糖、生物堿、多酚、黃酮等［2-3］，具有抗氧化、抗炎、降血糖、抑制胰脂肪酶等多種生物活性［4-6］，其中多酚是一種非常重要的次生代謝產(chǎn)物［7］，目前已有關(guān)于該成分提取工藝的報道［8-10］。但目前國內(nèi)外學(xué)者都是基于單一的溶劑法或超聲法提取蛋白桑葉多酚，尚未利用表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）的增溶作用來協(xié)同超聲提取，而且缺少藥理作用的研究。因此，本實驗優(yōu)化蛋白桑葉多酚的提取工藝，并評價其抗氧化、抑菌活性，以期為該資源綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 蛋白桑葉由黃山祁弘韻蛋白桑農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，于2018 年10 月采自安徽省祁門縣閃里鎮(zhèn)，經(jīng)黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院胡長玉教授鑒定為桑屬?？浦参锏鞍咨orus albaL.的葉。福林酚試劑、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丹寧酸、維生素C、DPPH、ABTS 等（美國Sigma 公司）；蛋白胨、牛肉膏、瓊脂（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）。

1.2 儀器 SQ510C 型高壓滅菌器（重慶雅馬拓科技有限公司）；SpectraMax-190 型全波長酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；SCQ-5201C 型數(shù)控加熱功率可調(diào)型超聲波清洗器（上海聲彥超聲波儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 多酚提取物制備 取干燥蛋白桑葉粉末2.0 g，按照1∶15 料液比加入0.6%SDS、60%乙醇，調(diào)節(jié)超聲溫度50 ℃，超聲功率200 W，超聲時間10 min，將提取液置于離心管中，3 000 r/min離心15 min，取上清液濃縮，即得。

2.2 多酚含有量測定 參考文獻［11］方法，并作適當(dāng)修改。精密配制25、50、75、100、150 μg/mL單寧酸對照品溶液，各取0.05 mL，與0.05 mL 福林酚試劑（0.25 mol/L）一同置于1.75 mL離心管中混合反應(yīng)3 min，加入1 mL 碳酸鈉溶液（0.7 mol/L），室溫下靜置1 h 后顯色，精密吸取0.2 mL 反應(yīng)液，置于酶標(biāo)儀上，在750 nm 波長處測定吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進行回歸，得方程為A＝0.001 7X+0.006 8（R2＝0.998 0），在25～150 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)上述方程，測定多酚含有量。

2.3 單因素試驗

2.3.1 SDS 用量 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶15、超聲溫度50 ℃、超聲功率200 W、超聲時間10 min，考察SDS 用量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%對多酚含有量的影響，結(jié)果見圖1。由此可知，SDS 用量小于0.4%時多酚含有量隨著其增加而升高，在0.4% 時達到最大值，為（11.49±0.04）mg/g，與未加SDS 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SDS 用量大于0.4%時多酚含有量反而略有降低，可能是其達到臨界膠束濃度后對該成分增溶作用的影響不大，但對其他雜質(zhì)影響較明顯［12］。因此，選擇 SDS 用量為0.2%～0.6%。

圖1 SDS 用量對多酚含有量的影響Fig.1 Effects of SDS consumption on polyphenols content

2.3.2 超聲功率 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶15、SDS 用量0.6%、超聲溫度50 ℃、超聲時間10 min，考察超聲功率100、150、200、250、300、350 W 對多酚含有量的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，超聲功率100～250 W 時多酚含有量隨著其增加而升高，在250 W 時達到最大值，為（11.28±0.20）mg/g，與100、150、200 W 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；超聲功率大于250 W時多酚含有量反而呈降低趨勢，可能是功率過高會使該成分發(fā)生分解［13］。因此，選擇超聲功率為200～300 W。

圖2 超聲功率對多酚含有量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on polyphenols content

2.3.3 超聲溫度 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶15、SDS 用量0.6%、超聲功率200 W、超聲時間10 min，考察超聲溫度30、40、50、60、70、80 ℃對多酚含有量的影響，結(jié)果見圖3。由此可知，提取溫度60 ℃時多酚含有量達到最大值，為（11.07±0.08）mg/g，與30、40、50 ℃比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；提取溫度高于60 ℃時多酚含有量反而明顯降低（P＜0.05），可能是高溫會影響超聲空化效果，而且可引起該成分發(fā)生分解［14］。因此，選擇超聲溫度為50～70 ℃。

圖3 超聲溫度對多酚含有量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on polyphenols content

2.3.4 超聲時間 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶15、SDS 用量0.6%、超聲溫度50 ℃、超聲功率200 W，考察超聲時間5、10、15、20、25 min對多酚含有量的影響，結(jié)果見圖4。由此可知，超聲時間5～15 min 時多酚含有量隨著其延長而升高，在15 min 時達到最大值，為（10.47±0.23）mg/g，與5、10 min 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；超聲時間大于15 min 時多酚含有量反而略有降低，可能是長時間超聲振動會破壞該成分結(jié)構(gòu)［15］。因此，選擇超聲時間為15 min，并且不進行后續(xù)考察。

圖4 超聲時間對多酚含有量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on polyphenols content

2.3.5 乙醇體積分?jǐn)?shù) 固定料液比1∶15、SDS用量0.6%、超聲溫度50 ℃、超聲功率200 W、超聲時間10 min，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%對多酚含有量的影響，結(jié)果見圖5。由此可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%～50%時多酚含有量隨著其增加而升高，在50% 時達到最大值，為（10.73±0.11）mg/g，與40%比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%時多酚含有量反而降低，可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過高會使蛋白質(zhì)等大分子變性沉淀，阻礙該成分從組織細胞向溶劑的擴散［16］。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～60%。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚含有量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on polyphenols content

2.3.6 料液比 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、SDS 用量0.6%、超聲溫度50 ℃、超聲功率200 W、超聲時間10 min，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 對多酚含有量的影響，結(jié)果見圖6。由此可知，料液比為1∶25 時多酚含有量達到最大值，為（13.58±0.05）mg/g，與1∶10、1∶15、1∶20 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），表明隨著溶劑用量升高該成分與溶劑的接觸面積增加，有利于其溶出，而擴散達到平衡后提取量不再升高［17］。因此，從濃縮成本考慮，選擇料液比為1∶25，并且不進行后續(xù)考察。

圖6 料液比對多酚含有量的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on polyphenols content

2.4 響應(yīng)面法 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇SDS用量（A）、超聲功率（B）、超聲溫度（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）作為影響因素，多酚含有量（Y）作為評價指標(biāo)，采用4 因素3 水平響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

對表2 數(shù)據(jù)進行擬合，得到多元回歸方程為Y＝15.41-0.36A+0.16B+0.12C-0.12D+0.27AB+0.20AC-0.30AD+0.31BC+0.28BD+0.15CD-0.54A2-0.32B2-0.74C2-0.44D2，方差分析見表3。由此可知，模型P＜0.000 1，表明模型達到極顯著水平；失擬項P＞0.05，表明未知因素對結(jié)果影響較小；R2為0.916 8，為0.833 6，表明模型擬合程度良好；變異系數(shù)為1.65%，表明該模型重復(fù)性、可靠性理想；因素A、B、AB、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2均達到顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.05）水平。響應(yīng)面分析見圖7。

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

圖7 各因素響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plots for various factors

由此得到，最優(yōu)提取工藝為SDS 用量0.34%，超聲功率259.92 W，超聲溫度60.89 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50.33%，多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.48 mg/g，考慮到生產(chǎn)操作的實際情況，將其修正為SDS 用量0.34%，超聲功率250 W，超聲溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。按照上述優(yōu)化工藝進行驗證試驗，測得多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（15.11±0.21）mg/g，與預(yù)測值15.48 mg/g 接近（相對誤差為2.45%），表明模型預(yù)測性良好。

2.5 還原能力 參考文獻［18］報道，并作適當(dāng)修改。取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL 提取液各50 μL，與1%鐵氰化鉀溶液、pH 6.6 磷酸緩沖液各50 μL 混合，置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min后取出，冷卻，加入10% 三氯乙酸50 μL，3 000 r/min 離心15 min，取上清液90 μL，加入蒸餾水100 μL、0.1%三氯化鐵10 μL，靜置10 min，在700 nm 波長處測定吸光度，以維生素C 為陽性對照，蒸餾水為空白對照，重復(fù)3 次，取平均值，結(jié)果見表4。由此可知，多酚還原能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)（P＜0.05），IC50為0.116 mg/mL。

表4 多酚還原能力測定結(jié)果（，n=3）Tab.4 Results of reducing capacity determination of polyphenols（，n=3）

表4 多酚還原能力測定結(jié)果（，n=3）Tab.4 Results of reducing capacity determination of polyphenols（，n=3）

注：同列不同字母表示相應(yīng)數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 ABTS 自由基清除能力 參考文獻［19］報道，并作適當(dāng)修改。將2.45 mmol/L 過硫酸鉀與7 mmol/L ABTS 自由基等量混勻后，靜置于暗處16 h，乙醇稀釋ABTS 自由基溶液直至在734 nm 處的吸光度為0.70±0.02，作為使用液。取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 提取液各50 μL、使用液100 μL，混勻后避光反應(yīng)5 min，在734 nm波長處測定吸光度Ai；將100 μL 使用液與50 μL蒸餾水混勻，5 min 后在734 nm 波長處測定吸光度A0；將100 μL 乙醇與0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 提取液各50 μL 混勻，靜置5 min，在734 nm 波長處測定吸光度Aj，以維生素C 為陽性對照，重復(fù)3 次，計算清除率，公式為清除率＝［（A0-Ai+Aj）/A0］×100%，結(jié)果見表5。由此可知，多酚清除能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)（P＜0.05），IC50為0.014 mg/mL。

表5 多酚清除能力測定結(jié)果（，n=3）Tab.5 Results of scavenging capacity determination of polyphenols（，n=3）

表5 多酚清除能力測定結(jié)果（，n=3）Tab.5 Results of scavenging capacity determination of polyphenols（，n=3）

注：同列不同字母表示相應(yīng)數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.7 抑菌活性 采用濾紙片擴散法［20-21］。在培養(yǎng)基中加入含有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌的菌懸液各100 μL，涂布均勻，在直徑6 mm 的濾紙片中央加入10 μL 提取液，以二甲基亞砜為空白對照，對羥基苯甲酸丙酯為陽性對照，37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h 后測定抑菌圈直徑。同時，將提取液依次稀釋至0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL，參照文獻［22］報道的方法觀察抑菌圈，將首次出現(xiàn)抑菌圈所對應(yīng)的提取液質(zhì)量濃度作為最低抑菌濃度（MIC），結(jié)果見表6。由此可知，在0.05～0.8 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，多酚對5種細菌的抑制作用呈量效關(guān)系（P＜0.05），對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC 均為0.2 mg/mL，而對普通變性桿菌、綠膿桿菌的MIC均為0.4 mg/mL。

表6 多酚抑菌活性測定結(jié)果（，n=3）Tab.6 Results of anti-bacterial activity determination of polyphenols（，n=3）

表6 多酚抑菌活性測定結(jié)果（，n=3）Tab.6 Results of anti-bacterial activity determination of polyphenols（，n=3）

注：同列不同字母表示相應(yīng)數(shù)據(jù)之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

本實驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化蛋白桑葉多酚提取工藝，測得多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達15.11 mg/g，較未添加SDS 提高了59.83%。代燕麗等［9］通過響應(yīng)面法對上述工藝進行了優(yōu)化，多酚得率提高了約38.8%，但仍低于本實驗結(jié)果，表明SDS 能顯著提高提取效率。

抗氧化實驗結(jié)果顯示，蛋白桑葉多酚具有顯著的還原能力，能有效清除ABTS 自由基，并與其質(zhì)量濃度呈顯著正相關(guān)。吳黌坦等［23］對金邊桑葉多酚提取物的抗氧化作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)其水提物對ABTS 自由基具有較強的清除能力，IC50值為41.25 μg/mL，高于本實驗的14 μg/mL，表明SDS協(xié)同超聲提取能較好地保留其抗氧化活性。抑菌實驗結(jié)果顯示，蛋白桑葉多酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌均具有較好的抑制作用，并呈明顯的劑量依賴性，高欣妍等［24］發(fā)現(xiàn)桑葉乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均具有一定抑制作用，MIC 為0.3 mg/mL，高于本實驗的0.2 mg/mL，表明優(yōu)化工藝能顯著增強上述活性。由此可知，加入表面活性劑SDS 協(xié)同超聲提取時，能較好地改善蛋白桑葉多酚的抗氧化、抑菌活性。