牛曉磊，賈潤霞，談秀鳳

（1.鄭州澍青醫(yī)學高等專科學校，河南 鄭州 450064；2.河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004；3.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203）

橙皮苷是從陳皮等中藥中提取、分離得到的黃酮類化合物，對婦科炎癥［1-3］、子宮內(nèi)膜癌［4］、子宮內(nèi)膜異位癥［5］、子宮癌［6］、卵巢癌［7］等均具有較好的療效，但其水溶性、脂溶性均很差［8］，溶出度很低，導致體內(nèi)口服困難［9］，從而限制了藥效發(fā)揮。因此，促進橙皮苷體內(nèi)吸收、提高其口服吸收生物利用度是擴大相關(guān)臨床應用的關(guān)鍵。

磷脂復合物固體分散體近年來逐漸受到國內(nèi)外醫(yī)藥研發(fā)人員的關(guān)注［10-13］，它實際上是磷脂復合物、固體分散體的聯(lián)合使用，不僅可提高藥物脂溶性（磷脂復合物），也能提高其水溶性（固體分散體），從而促進藥物體內(nèi)吸收，提高療效［11］。因此，本實驗制備了橙皮苷磷脂復合物固體分散體，并對其體外基本性質(zhì)和體內(nèi)藥動學進行研究，以期為相關(guān)新型制劑的開發(fā)提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 型HPLC 色譜儀（配置DAD 檢測器，美國Agilent 公司）；ZA305AS 型電子分析天平（上海贊維衡器有限公司）；JB-13 型磁力攪拌器（上海儀田精密儀器有限公司）；XD-5000A 型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海賢德實驗儀器有限公司）；HY-5 型回旋振蕩器（金壇市億能實驗儀器廠）；D8 型X 射線粉末衍射儀（德國布魯克公司）；JN300-2 型氮氣吹掃儀（吉米諾儀器公司）。

1.2 試劑與藥物 橙皮苷原料藥（批號180325，純度95.4%，美國Mannstedt 公司）；橙皮苷對照品（批號110721-201818，純度96.2%，中國食品藥品檢定研究院）；毛蕊異黃酮苷對照品（批號WK170618，純度99.4%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVK K30，批號171101，河北科隆多科技有限公司）；大豆磷脂（批號DDT20180223，鄭州豫和食品添加劑有限公司）。

1.3 動物 清潔級SD 大鼠，體質(zhì)量250～280 g，購自河南省動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（豫）2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 橙皮苷含有量測定（HPLC 法）

2.1.1 色譜條件 Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相1%乙酸-甲醇（35∶65）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長286 nm；柱溫35 ℃。

2.1.2 方法學考察 精密稱取10 mg 橙皮苷對照品于250 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解后定容至刻度，取適量用流動相制成10、5、1、0.1、0.05、0.01 μg/mL對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝19.247 3X+1.267 4（r＝0.999 8），在0.01～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取0.01、1、10 μg/mL 對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷日內(nèi)、日間精密度RSD 均小于1.62%。取橙皮苷磷脂復合物固體分散體粉末約10 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇超聲溶解后定容至刻度，精密量取1 mL于10 mL 量瓶中，流動相定容至刻度，作為供試品溶液，取適量于0、4、8、12、24、48 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷峰面積RSD 為0.62%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。配制9 份空白磷脂-PVPK30 溶液，每份10 mL，加入 0.5、1.0、1.5 mL 對照品溶液（1 μg/mL）各3 份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷平均加樣回收率為99.14%～100.08%，RSD 為1.82%。

2.2 橙皮苷磷脂復合物固體分散體制備 將橙皮苷對照品置于45 ℃真空干燥箱中48 h 以除盡水分，取120 mg，與170 mg 大豆磷脂一同置于二氯甲烷中，55 ℃水浴中攪拌3 h 得澄清溶液，真空減壓旋干至淺黃色殘留物，即為磷脂復合物。取100 mg加到100 mL 無水乙醇中，振蕩溶解后過0.22 μm微孔濾膜，加入400 mg PVP K30，55 ℃水浴中攪拌4 h 得澄清溶液，真空減壓旋干至白色殘留物，即得，粉碎后置于棕色干燥器中。平行制備3 批樣品，測得橙皮苷平均質(zhì)量分數(shù)為8.21%。

2.3 晶型分析 采用X 射線粉末衍射（XRPD），掃描條件為銅靶，掃描速度8°/min，管壓40 kV，掃描范圍3°～45°。取橙皮苷、輔料混合物（磷脂+PVP K30）、物理混合物（橙皮苷+磷脂+PVP K30）、橙皮苷磷脂復合物固體分散體適量，置于玻璃槽中，玻璃片壓制平整后進行掃描，結(jié)果見圖1。由此可知，橙皮苷主要以結(jié)晶狀態(tài)存在，輔料混合物呈無定型狀態(tài)，物理混合物仍可見橙皮苷典型結(jié)晶峰，而橙皮苷磷脂復合物固體分散體中橙皮苷由結(jié)晶型轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型，表明該劑型制備成功。

圖1 各樣品XRPD 圖Fig.1 XRPD spectra for various samples

2.4 表觀溶解度測定 采用飽和溶劑法［13］。取過量橙皮苷、物理混合物、橙皮苷磷脂復合物固體分散體于水或正辛醇中，25 ℃下磁力攪拌48 h 后5 000 r/min離心10 min，取上清液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表1。由此可知，磷脂復合物固體分散體將橙皮苷在水、正辛醇中的溶解度分別提高了8.76、4.29 倍。

表1 各樣品表觀溶解度測定結(jié)果（μg/mL，，n=3）Tab.1 Results of apparent solubility determination of various samples（μg/mL，，n=3）

表1 各樣品表觀溶解度測定結(jié)果（μg/mL，，n=3）Tab.1 Results of apparent solubility determination of various samples（μg/mL，，n=3）

2.5 體外溶出度測定 取橙皮苷及其磷脂復合物固體分散體（含5 mg 橙皮苷）適量，空白溶出介質(zhì)制成2 mL 混懸液，分別置于透析袋（分子量8 000～14 000 Da）中，固定于攪拌槳上，以900 mL 0.5% SDS 溶液為釋放介質(zhì)，37 ℃下100 r/min攪拌一段時間（保持總體積不變），攪拌結(jié)束后取適量溶液過0.45 μm 微孔濾膜，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖2。由此可知，橙皮苷12 h 內(nèi)溶出度僅為18.63%，而其磷脂復合物固體分散體在3 h 內(nèi)基本完全溶出。

圖2 各樣品體外溶出曲線Fig.2 In vitro dissolution curves for various samples

2.6 藥動學研究

2.6.1 藥液制備 分別取橙皮苷及其磷脂復合物固體分散體適量，加入0.5% CMC-Na 溶液，超聲處理10 s，即得（質(zhì)量濃度以橙皮苷計，均為8 mg/mL）。

2.6.2 分組、給藥及采血 12 只大鼠禁食過夜后，隨機分為橙皮苷組、橙皮苷磷脂復合物固體分散體組，每組6 只，灌胃給予“2.6.1 項下藥液”，劑量均為80 mg/kg。乙醚麻醉大鼠后，于0.167、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12 h 眼眶取血各0.3 mL（適當補充生理鹽水），置于離心管中（加1～2 滴肝素浸潤管壁），2 500 r/min 離心3 min，冷凍保存血漿樣品。

2.6.3 內(nèi)標溶液制備及血漿樣品處理 參考文獻［14］報道。稱取10 mg 毛蕊異黃酮苷溶于50 mL甲醇中，甲醇再稀釋至1 μg/mL 作為內(nèi)標溶液。取“2.6.2”項下血漿樣品100 μL、內(nèi)標溶液50 μL，加入1.0 mL 乙腈渦旋3 min，室溫下靜置10 min 后8 000 r/min 離心5 min，分離有機相，氮氣吹干，加入100 μL 甲醇復溶后密封待測。

2.6.4 線性關(guān)系考察 取橙皮苷對照品適量，甲醇制成10.0、5.0、2.5、1.0、0.1 μg/mL 溶液，各取100 μL，氮氣吹干后加入100 μL 空白血漿溶解，按“2.6.3”項下方法處理后在“2.1.1”項色譜條件下進樣20 μL 測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），橙皮苷、內(nèi)標（毛蕊異黃酮苷）峰面積比值為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝0.101 4X+0.298 4（r＝0.992 3），在0.1～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.5 方法學考察 取“2.6.2”項下血漿樣品，于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得橙皮苷峰面積RSD 為9.92%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取“2.6.4”項下10.0、5.0、0.1 μg/mL 對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得橙皮苷峰面積RSD 分別為2.31%、4.76%、6.14%，表明儀器精密度良好。取“2.6.4”項下5.0、2.5、1.0 μg/mL 對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定9 次，測得橙皮苷加樣回收率為90.22%～95.19%，RSD 為10.16%。將僅含橙皮苷的血漿樣品（0.1 μg/mL）逐步稀釋，以S/N＝10 為定量限，S/N ＝3 為檢測限，測得兩者分別為12、5 ng/mL。

2.6.6 結(jié)果分析 血藥濃度-時間曲線見圖3，相關(guān)數(shù)據(jù)通過DAS2.0 軟件進行處理，并采用非房室模型計算主要藥動學參數(shù)，結(jié)果見表2。由此可知，磷脂復合物固體分散體t1/2、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞高于原料藥（P＜0.05，P＜0.01），Tmax無明顯變化（P＞0.05），相對生物利用度提高至2.54 倍。

圖3 各樣品血藥濃度-時間曲線Fig.3 Plasma concentration-time curves for various samples

3 討論與結(jié)論

對于生物藥劑學分類系統(tǒng)（BCS）Ⅳ藥物來說，提高其水溶性、脂溶性有助于解決吸收瓶頸［15-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，磷脂復合物固體分散體將橙皮苷在水、正辛醇中的溶解度分別提高了8.76、4.29 倍，同時增加了其溶出率及累積溶出度，可為改善其生物利用度奠定了基礎(chǔ)。

表2 各樣品主要藥動學參數(shù)（，n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for various samples（，n=6）

表2 各樣品主要藥動學參數(shù)（，n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for various samples（，n=6）

體內(nèi)藥動學研究結(jié)果顯示，磷脂復合物固體分散體可降低藥物體內(nèi)消除速度，導致其t1/2顯著延長，在其他研究中也有類似報道［18-19］；Cmax提高了2.27 倍，生物利用度提高至2.54 倍，表明它能顯著促進藥物體內(nèi)吸收；Tmax無明顯變化，可能是由于磷脂復合物一般可使該參數(shù)延后［20-21］，而固體分散體一般可使其提前［13］，兩者聯(lián)用后上述作用恰好相互抵消。另外，橙皮苷在體內(nèi)還會受到腸道內(nèi)各種代謝酶、腸道菌群、水解、外排轉(zhuǎn)運載體等因素的影響，最終會制約其生物利用度的提高程度［22］。

綜上所述，本研究制備的橙皮苷磷脂復合物固體分散體溶解性、生物利用度良好，有利于后續(xù)進一步相關(guān)研究（如片劑、膠囊等），從而為臨床提供一種安全、有效的婦科用藥。