李唯源 張 志 李 昂 付 寧 宋琴琴 劉 沖 呂 瀾 張浩良 張雪梅

華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科 河北唐山 063000；①華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

肝癌是目前全球常見的癌癥類型之一，發(fā)病率高且病死率也在逐年上升[1]。2015年我國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肝癌發(fā)病率為9.42%，位居第4位，病死率為13.94%，位居第2位[2]。研究表明肝癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素相關(guān)：包括黃曲霉毒素B暴露，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染，煙酒過量，鐵超載和糖尿病[3]。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)作為一種常見的人類可遺傳的變異，與癌癥易感性密切相關(guān)[4]。Gao J等研究表明，個(gè)體的遺傳變異影響肝癌的發(fā)生發(fā)展[5]。

TLR4作為Toll樣受體(TLRs)家族重要的信號(hào)通路之一，可通過SNPs影響癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。國內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示：TLR4基因在宮頸癌[6]、皮膚癌[7]、胃癌[8]、肝癌[9]等多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用。rs7873784G>C位于TLR4基因3’UTR端，喬艷等[10]通過病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)TLR4 rs7873784變異與結(jié)直腸癌易感性相關(guān)，攜帶GC/CC基因型個(gè)體較攜帶GG基因型個(gè)體結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低。該位點(diǎn)與肝癌易感性關(guān)系暫無涉及。本研究采用成組設(shè)計(jì)的病例對(duì)照研究方法，探討TLR4基因3’UTR端rs7873784 G>C變異對(duì)肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響，為臨床提供更多潛在預(yù)防和治療策略。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2011～2015年在華北理工大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院和華北理工大學(xué)附屬唐山市人民醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診的原發(fā)性肝癌患者240例納入觀察組，均未接受過放化療及靶向治療且無其他惡性腫瘤病史。隨機(jī)選取同期在唐山地區(qū)且與觀察組無血緣關(guān)系的體檢健康者500例為對(duì)照組。采取查閱病歷資料和問卷調(diào)查方法收集研究對(duì)象一般人口學(xué)資料及臨床病理資料。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào):20190321)。

1.2DNA提取 抽取研究對(duì)象外周靜脈血2mL，使用天根生化科技(北京)有限公司血液基因組DNA提取試劑盒(DP318)提取DNA，提取物置于-20℃冰箱保存。

1.3基因型分析 利用TaqMan-MGB探針法進(jìn)行基因分型TaqMan-MGB探針序列：ContextSequence(VIC/FAM):TCATGTACTAGTGAAAGTAGATGTG(C/T)GCATTTGTGCACATAT。PCR反應(yīng)在ABI 7900HT Fast Real-TimePCR儀中進(jìn)行。反應(yīng)體系含TLR4 rs7873784探針0.065μL，基因組DNA 1μL(0.1～20ng)，2×PCR mix(TaqManUniversal Master Mix Ⅱ，Applied Biosystems ABI)2.0μL，加水補(bǔ)足至5μL。反應(yīng)條件為：50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，95℃ 15秒，60℃ 1分鐘，60個(gè)循環(huán)。使用ABI SDS 2.4軟件進(jìn)行結(jié)果判斷和分析。每個(gè)檢測(cè)單元均設(shè)立陰性對(duì)照及兩個(gè)以上隨機(jī)重復(fù)樣本進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0(Version 23.0；IBM，NY，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。研究對(duì)象性別、年齡和吸煙狀況基本特征分析均采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson擬合優(yōu)度檢驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)照組是否符合Hardy-Weinberg遺傳定律。采用非條件Logistic回歸分析基因遺傳變異與肝癌易感性的關(guān)系，以比值比(OR)及其95%置信區(qū)間來表示相對(duì)危險(xiǎn)度。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組基本資料的比較 其中觀察組男188例(78.3%)，女52例(21.6%)；對(duì)照組男374例(74.8%)，女126例(25.2%)。兩組性別、年齡和是否吸煙比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。對(duì)TLR4 rs7873784對(duì)照進(jìn)行擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，該SNP位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，該研究人群具有代表性。

表1 兩組研究對(duì)象基本資料比較[例(%)]

2.2TLR4 rs7873784基因多態(tài)性與肝癌易感性的關(guān)系 為探索TLR4 rs7873784基因型分布與肝癌易感性的關(guān)系，對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行分析，表2顯示，觀察組中TLR4 rs7873784GG基因攜帶者222(92.5%)例，GC+CC基因攜帶者18(7.5%)例，對(duì)照組中TLR4 rs7873784GG基因攜帶者424(84.8%)例，GC+CC基因攜帶者76(15.2%)例，經(jīng)非條件Logistic回歸分析，相比于TLR4 rs7873784 GG基因型攜帶者，至少攜帶一個(gè)C等位基因者可能會(huì)降低肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.45，95%CI=0.26～0.77，P=0.004)。

表2 TLR4 rs7873784G>C遺傳變異與肝癌風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的分析[例(%)]

2.3TLR4rs7873784G>C遺傳變異與肝癌易感性關(guān)系分層分析 為進(jìn)一步探討TLR4rs7873784遺傳變異與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，本研究對(duì)性別、年齡和吸煙進(jìn)行分層分析，見表3。

表3 TLR4 rs7873784G>C遺傳變異與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分層分析

在性別分層中，與TLR4 rs7873784G>C GG基因型相比，GC+CC基因型可減少男性患者肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)，但在女性患者中無明顯差異(P>0.05)。

年齡分層顯示，在>60歲年齡組中，TLR4rs7873784至少攜帶一個(gè)C等位基因者較GG基因型攜帶者具有較低的肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.34，95%CI=0.14～0.85，P=0.021)，而在≤60歲年齡組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

吸煙分層顯示，與TLR4 rs7873784G>C GG基因型相比，至少攜帶一個(gè)C等位基因型的非吸煙組降低了肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.27，95%CI=0.16～0.59 ，P=0.001)而在吸煙組中并不影響肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P>0.05)。

3 討論

TLRs屬于Ⅰ型跨膜蛋白的天然免疫模式識(shí)別受體，可以識(shí)別外源性以及組織衍生的促進(jìn)炎癥的分子信號(hào)[11]。TLR4作為TLRs家族至關(guān)重要的信號(hào)通路之一，可以識(shí)別胞外抗原，對(duì)胞內(nèi)損失相關(guān)因子產(chǎn)生應(yīng)答，通過SNPs影響癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[12]。研究表明[10]，TLR4 rs7873784 G>C變異影響hsa-let-7d-3p及hsa-let-7e-3p與TLR4基因3’，UTR之間的互補(bǔ)結(jié)合，抑制癌癥的發(fā)生。Jin Y等研究發(fā)現(xiàn)在我國漢族人群TLR4 rs7873784-G等位基因攜帶者患宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)明顯高于C等位基因型的攜帶者[13]，TLR4 rs7873784遺傳變異影響宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4 rs7873784至少攜帶一個(gè)C等位基因較GG基因型攜帶者顯著降低肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，Zi-Cheng Jiang等研究發(fā)現(xiàn)[14]，TLR4 SNPs影響肝癌易感性，與本研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)：年齡和性別為肝癌發(fā)生和發(fā)展的危險(xiǎn)因素[15]，本研究通過性別分層分析發(fā)現(xiàn)，TLR4 rs7873784 GC+CC基因型攜帶者較GG基因型攜帶者顯著降低了男性肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這可能與男性職業(yè)和社會(huì)關(guān)系等有關(guān)，使得其更易暴露于肝癌危險(xiǎn)因素中，也可能與男女間激素水平差異有關(guān)[16]。通過年齡分層發(fā)現(xiàn)，在>60歲年齡組中TLR4 rs7873784 GC+CC基因型攜帶者較GG基因型攜帶者降低肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，表明年齡和TLR4 rs7873784G>C遺傳變異可能共同影響肝癌易感性。另研究發(fā)現(xiàn)長期大量吸煙, 使亞硝胺、芳香胺等多種致癌物質(zhì)長久作用于肝臟，導(dǎo)致肝癌的發(fā)生[17]。本研究表明在非吸煙者中TLR4 rs7873784G>C至少攜帶一個(gè)C等位基因者較GG基因攜帶者罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。

本研究表明，TLR4 rs7873784G>C至少攜帶一個(gè)C等位基因能夠降低肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為TLR4 rs7873784G>C作為肝癌治療可能的潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，但仍需結(jié)合最新的理論成果及肝癌其他危險(xiǎn)因素并在更大樣本量的人群中進(jìn)一步研究證實(shí)。