桑成晨,錢 龍

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性、炎癥性和系統(tǒng)性自身免疫疾病，臨床主要表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、腫脹、畸形，嚴重時可導致殘疾，同時它可以累及肺、心臟和眼睛等關節(jié)外器官，并且與心血管疾病、感染、淋巴瘤和預期壽命降低的風險增加有關。RA的確切病因尚不清楚，許多研究提示環(huán)境和遺傳因素綜合作用參與其發(fā)病，目前認為炎癥的小分子介質(如花生四烯酸代謝產(chǎn)物)、自身抗體、細胞因子、生長因子、趨化因子、黏附分子、表觀遺傳學、異常信號轉導和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)均與RA的發(fā)病機制有關。表觀遺傳學與RA的研究進展表明微小RNA(microRNA，miRNA)與RA發(fā)病機制之間有緊密關系，近年來有學者研究證實外泌體可通過傳遞miRNAs參與RA發(fā)病機制[1]。該研究通過檢測miR-16-5p和miR-223-3p在RA患者和正常人血漿外泌體中的表達水平進一步探討外泌體miRNAs和RA之間的確切聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院風濕免疫科2017年10月～2019年10月的RA住院患者56例，按照患者基于C反應蛋白(C reaction protein，CRP)水平計算的28個關節(jié)疾病活動性評分(disease activity score 28-CRP，DAS28-CRP)來區(qū)分RA活動度，其中病情活動組(DAS28-CRP≥3.2)和穩(wěn)定組(DAS28-CRP<2.6)各28例。同時收集24例健康體檢者作為對照組。本研究獲得研究對象知情同意及安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 納入、排除標準所有病例組患者診斷均符合美國風濕病學會1987年RA分類診斷標準，對照組為同期健康體檢者，研究對象均為無血緣關系漢族人，各組年齡及性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。選取的研究對象均排除感染、代謝、腫瘤和其他自身免疫性疾病。

1.3 一般資料記錄所有患者以下臨床資料：姓名、年齡、性別、類風濕因子(rheumatoid factor，RF)滴度、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibodies，Anti-CCP)滴度、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、CRP、關節(jié)壓痛數(shù)(tender joint count,TJC)、關節(jié)腫脹數(shù)(swollen joint count,SJC)、關節(jié)超聲、關節(jié)平片等，并計算RA患者DAS28評分。

1.4 實驗流程采集RA患者與正常人晨血標本10 ml，離心取上層血漿后，按照試劑盒說明書使用Qiagen公司的外泌體提取試劑盒(exoEasy Maxi kit)提取外泌體。以miR-451a作為內對照，采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應技術(RT-qPCR)對外泌體中miR-16-5p和 miR-223-3p進行定量檢測，使用2-△△CT計算其相對表達水平。

2 結果

2.1 一般資料統(tǒng)計分析在RA組及健康對照組，RA病情活動組及穩(wěn)定組中，性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、表2。

表1 RA組與健康對照組的一般資料比較

表2 RA病情活動組與穩(wěn)定組的一般資料比較

2.2 RA組和健康對照組血漿外泌體中miR-16-5p的表達RA組及健康對照組血漿外泌體中均檢測到miR-16-5p，其在RA組[1.852 (1.084，2.532)]中的表達高于健康對照組[0.995 (0.572，1.798)]，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.310，P=0.021)(圖1)。

圖1 miR-16-5p在RA組和健康對照組血漿外泌體中的表達

2.3 RA病情活動組和穩(wěn)定組血漿外泌體中miR-16-5p的表達血漿外泌體miR-16-5p在RA活動組[1.427(0.950,2.314)]中的表達水平與RA穩(wěn)定組[1.970(1.248,2.857)]相當，差異無統(tǒng)計學意義(Z=-1.573，P=0.116)(圖2)。

2.4 RA組和健康對照組血漿外泌體中miR-223-3p的表達RA組與健康對照組外泌體中均檢測到miR-223-3p，RA組[106.611(46.813，223.841)]血漿外泌體miR-223-3p的表達水平高于健康對照組[47.586 (8.115，101.347)]，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-2.845，P=0.004)(圖3)。

圖2 miR-16-5p在RA病情活動組和穩(wěn)定組血漿外泌體中的表達

圖3 miR-223-3p在RA組和健康對照組血漿外泌體中的表達

2.5 RA病情活動組和穩(wěn)定組血漿外泌體中miR-223-3p的表達血漿外泌體miR-223-3p在RA活動組[199.615(104.944，305.090)]中的相對表達水平比RA穩(wěn)定組[53.993(21.524，107.707)]升高,差異有統(tǒng)計學意義(Z=-4.097，P=0.000)(圖4)。

圖4 miR-223-3p在RA病情活動組和穩(wěn)定組血漿外泌體中的表達

2.6 血漿外泌體miR-16-5p、miR-223-3p相對表達水平與臨床相關指標的相關性相關性結果分析顯示，RA患者血漿外泌體miR-16-5p與RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR、CRP、TJC、SJC、DAS28-CRP和DAS28-ESR等臨床指標均無相關性(P>0.05)；miR-223-3p相對表達水平與患者RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR和CRP均無相關性，但與TJC、SJC、DAS28-CRP、DAS28-ESR評分呈正相關(P<0.05)，見表3。

表3 RA患者血漿外泌體miRNAs相對表達和臨床指標的相關性分析

3 討論

RA病程中關節(jié)的破壞給患者、社會均造成了沉重負擔，明確RA的發(fā)病機制、尋找其早期診斷的生物標志物及開發(fā)理想的RA治療藥物是迫切的醫(yī)學需求。外泌體是一種由多種細胞分泌可進入細胞外環(huán)境的異質性囊泡，其內包含脂質、蛋白質、多種核酸等物質，Takamura et al[2]鑒定了RA成纖維樣滑膜細胞系(即MH7A)的外泌體RNA，發(fā)現(xiàn)miR-155和miR-146a在源自MH7A的外泌體中表達，并且在TNF-α刺激后的外泌體中的表達是升高的，提示外泌體可能通過傳遞miRNAs參與RA發(fā)病機制。miRNAs作為進化高度保守的一類小分子RNA參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育和免疫功能的調節(jié)，研究顯示miR-16[3-4]、miR-223[5-6]在 RA患者的血清、外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)、關節(jié)滑液、滑膜組織等標本中均異常表達，因miRNAs與外泌體結合后不受內源性核糖核酸酶活性的影響而穩(wěn)定存在[7]，表明外泌體miRNAs有成為新的疾病生物標志物的潛能。故本研究通過檢測miR-16-5p和miR-223-3p在血漿外泌體中的表達水平，并進行臨床相關性分析，進一步探討外泌體miRNAs在RA發(fā)病及疾病進展中的意義。

miR-16被位于人類3號和13號染色體上的兩個基因編碼，Jing et al[8]通過分析從人細胞中分離的miR-16的序列發(fā)現(xiàn)miR-16包含可以與TNF-α mRNA中的ARE基因配對的UAAAUAUU序列，破壞miR-16前體pre-miR16-1后可顯著降低HeLa細胞中miR-16的水平，并延長了TNF-a mRNA的半衰期，從而推測其參與ARE介導的TNF-α mRNA降解過程，而TNF-α在RA的發(fā)病機制中起重要作用，這似乎說明miR-16可能參與RA的發(fā)生。Wu et al[9]的研究進一步發(fā)現(xiàn)RA患者PBMC中的Th17和Treg細胞中miR-16的表達與轉錄因子RORγt和FoxP3的表達密切相關，說明miR-16可能通過影響RORγt和FoxP3的表達而參與RA患者的Th17/Treg失衡。隨后孫寅 等[4]發(fā)現(xiàn)miR-16在RA患者血漿、PBMC和關節(jié)滑液中的表達水平均高于健康對照組，其表達水平由低到高分別為PBMC、關節(jié)滑液和血漿，且RA患者血漿miR-16的表達與DAS28呈負相關，PBMC中miR-16的表達與DAS28評分、ESR及CRP呈正相關。而Murata et al[10]研究結果顯示滑液中miR-16的濃度與RA臨床指標MMP-3、CRP、ESR、DAS28、SJC、TJC均無相關性。本研究檢測了RA患者和健康對照組的血漿外泌體miR-16-5p的相對表達量，發(fā)現(xiàn)其在RA患者中的表達高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示其可能參與RA發(fā)病。但外泌體miR-16-5p在RA病情活動組及穩(wěn)定組中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),且其表達水平與RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR、CRP、TJC、SJC、DAS28-CRP和DAS28-ESR等臨床指標均無相關性(P>0.05)，結合既往研究中miR-16在RA患者血漿、關節(jié)滑液和PBMC中的表達水平存在明顯差異，考慮miR-16在不同標本中的來源不同，并可能存在不同的miRNA表達譜，需要加大樣本量進行更深入的研究明確外泌體miR-16參與RA發(fā)病的作用機制。

miR-223位于人類X染色體q12上，F(xiàn)ulci et al[6]首次表征了RA患者外周T淋巴細胞的miRNA表達譜，與正常人相比，RA患者CD4+原始T淋巴細胞中miR-223的表達顯著升高，而正常人的原始CD4 T細胞用T細胞抗原受體刺激后也未檢測到miR-223的表達，說明RA患者中miR-223的過表達與RA發(fā)病相關。Sugatani et al[11]的研究顯示miR-223通過轉錄因子PU.1/miR-223/核因子1A(nuclear factor1-A，NFI-A)/巨噬細胞集落刺激因子受體(macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CSFR)反饋通路調控破骨細胞的生成。在這個反饋環(huán)中，M-CSFR可以上調PU.1水平刺激miR-223的表達，過表達的miR-223下調NFI-A水平促進破骨細胞的生成，同時NFI-A表達水平的降低使M-CSFR的表達水平升高，而M-CSFR對破骨細胞的分化和功能至關重要。隨后Li et al[5]在RA患者關節(jié)滑膜和CIA小鼠模型中的實驗進一步證實了Sugatani et al[11]的結論，提示miR-223可能成為RA的潛在治療靶點。近期孫廣 等[12]研究了RA患者血清外泌體miR-223的表達水平，發(fā)現(xiàn)RA患者血清外泌體miR-223的相對表達量顯著高于健康對照組，且其表達量與RA患者DAS28評分、血清Anti-CCP滴度、RF滴度 、CRP及ESR水平正相關。在本研究中，相對于健康對照組，RA患者血漿外泌體miR-223-3p的表達增高(P<0.05)，這與孫廣 等[12]的研究結果一致，同時本研究發(fā)現(xiàn)外泌體miR-223-3p在RA活動組的表達水平高于RA穩(wěn)定組(P<0.05)，進一步說明外泌體miR-223-3p可能參與RA疾病的發(fā)展。相關性分析結果顯示RA患者血漿外泌體miR-223-3p相對表達水平與RF滴度、Anti-CCP滴度、ESR和CRP均無相關性(P>0.05)，這個結果與孫廣 等[12]的研究結果存在不同，考慮可能有以下原因：① 目前的大量研究在RF滴度、Anti-CCP滴度 、ESR及CRP水平與RA疾病活動度是否相關的問題上存在分歧，這可能與不同實驗方法測定出的指標值存在差異以及活動期RA患者的炎癥指標與滑膜炎嚴重程度并不一致[13]有關；② 來自于同一發(fā)夾結構pre-miRNA的相反兩臂命名時后綴加“-3p”(表示從3′ 端的臂加工而來)或“-5p”(表示從5′ 端的臂加工而來)，如miR-223-3p 和miR-223-5p，它們在不同組織的表達量不同，本研究選取表達量較高且特異性較高的miR-223-3p進行研究，而孫廣 等[12]的研究中并未提及測定的miR-223序列；③ 本研究中選擇的內參與相對表達量計算方法與孫廣 等[12]的不同，這可能導致了不同的結果。同時本研究中RA患者血漿外泌體miR-223-3p相對表達水平與TJC、SJC、DAS28-CRP、DAS28-ESR均呈正相關(P<0.05)，這說明外泌體miR-223-3p不僅參與RA的發(fā)病，還可能用來評估RA患者的疾病活動情況，但其可否成為RA的潛在治療靶點還需要更多的實驗證實。

本研究通過檢測miR-16-5p和miR-223-3p在RA患者和正常人血漿外泌體中的表達，發(fā)現(xiàn)其有可能成為RA篩查、診斷、評估病情的生物標志物。考慮到目前各種研究中定量方法、不同患者的疾病活動和藥物治療情況以及樣本類型(全血、分離細胞亞群、滑膜組織、滑液等) 的不一致性，應當注意這些研究結果間的偏差，這可能會推遲miRNAs作為RA疾病生物標志物的應用。