任振娟 張海杰 蘇云開 馬巖 劉耀

目前，我國(guó)耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者日益增多，一線抗結(jié)核藥品已無法滿足臨床治療的需要。針對(duì)MDR-TB的治療，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)[1]推薦使用二線注射用抗結(jié)核藥品，包括氨基糖苷類藥物阿米卡星(Am)、卡那霉素(Km)和多肽類藥物卷曲霉素(Cm)。Am作為治療MDR-TB的核心二線抗結(jié)核藥品，主要作用于細(xì)菌核糖體，干擾其蛋白正常合成，在體外也有較強(qiáng)的殺菌活性。本研究通過實(shí)驗(yàn)室方法判斷MDR-MTB菌株對(duì)Am的耐藥性及其耐藥分子特點(diǎn)，同時(shí)比較絕對(duì)濃度法和微孔板阿爾瑪藍(lán)試驗(yàn)(microplate Alamar blue assay，MABA)法的藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果，建立MDR-MTB對(duì)Am耐藥的藥品體外最低抑菌濃度(MIC)的最佳耐藥判斷臨界值(cut-off值)。

材料和方法

1.菌株選擇：159株MTB臨床分離株均來自內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院參比實(shí)驗(yàn)室，為2005年和2015年到院就診患者的臨床分離菌株。根據(jù)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]，菌株均經(jīng)羅氏培養(yǎng)陽性且硝基苯甲酸(PNB)菌種鑒定為MTB，培養(yǎng)基中PNB濃度為500 μg/ml；且經(jīng)絕對(duì)濃度法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)提示至少同時(shí)耐異煙肼和利福平，即為MDR-MTB菌株。作為本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株的H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株來源于內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院參比實(shí)驗(yàn)室。

2.試劑及儀器： Am(美國(guó)Sigma-Aldric公司)，Alamar blue顯色液(美國(guó)Bio-Rad公司)，7H9培養(yǎng)基粉及OADC營(yíng)養(yǎng)添加劑(美國(guó)BD公司)，羅氏培養(yǎng)基(珠海銀科公司)，恒溫培養(yǎng)箱(BD720，德國(guó)Binder公司)，F(xiàn)OTODYNE凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Image公司)，Bio-Rad s1000基因擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)，超低溫冰箱(日本SANYO公司)。

3.MABA法：將MDR-MTB臨床分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于空白羅氏中性培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3～4周。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株，刮菌、研磨，并通過比濁配置為1麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙篬1×107菌落形成單位 (CFU)/ml]。使用7H9液體培養(yǎng)基(加入10%的OADC)及96孔微孔板，將藥物濃度梯度稀釋，由第12列至第2列，Am的終濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/ml。第1列為空白對(duì)照。以標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv作為對(duì)照。37 ℃孵育1周后加Alamar blue顯色液顯色，37 ℃再孵育24 h，記錄各孔的顏色。判讀時(shí)，根據(jù)MIC的定義，即阻止顏色變化(從藍(lán)色變?yōu)榉奂t色)的最低藥物濃度?？诪樗{(lán)色記為無生長(zhǎng)，孔為粉紅色為生長(zhǎng)，出現(xiàn)紫紅色孔，則再繼續(xù)37 ℃ 培養(yǎng)24 h。后續(xù)不變?yōu)榉奂t色，同時(shí)其相連的藍(lán)色孔仍為藍(lán)色，則記錄為有生長(zhǎng)。美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Stan-dards Institute，CLSI)推薦的Am耐藥判讀臨界濃度為1 mg/L[3]。

4.絕對(duì)濃度法：根據(jù)中國(guó)防癆協(xié)會(huì)制訂的《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程》[4]，將上述1麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，稀釋?0-2mg/ml后用微量吸管接種0.1 ml至對(duì)照及含藥培養(yǎng)基上。含藥培養(yǎng)基中Am的藥物濃度為10、100 μg/ml。37 ℃培養(yǎng)4周后報(bào)告結(jié)果。低濃度含藥培養(yǎng)基生長(zhǎng)分枝桿菌報(bào)告耐藥(R)，未生長(zhǎng)者報(bào)告敏感(S)。

5.菌株DNA提取及目的基因擴(kuò)增和測(cè)序：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株，刮菌后轉(zhuǎn)移至含有1000 μl生理鹽水的離心管中，充分渦旋震蕩混勻后，80 ℃ 30 min滅活，12 000×g離心5 min后，棄上清，沉淀用500 μl TE緩沖液重懸，再100 ℃ 10 min，12 000×g離心3 min后，取上清，即擴(kuò)增所用的DNA模板。PCR反應(yīng)引物序列為F：5′-GTCAACTCGGAGGAAGGTGG-3′，R:5′-GTCCGAGTGTTGCCTCAGG-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s變性，58 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min后延伸。取得PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后確認(rèn)目的片段大小一致，且具有清晰條帶后，送由北京睿博生物公司進(jìn)行核苷酸序列分析。

6.序列分析：利用Bio Edit v7.2.5軟件“Multi-way alignment”分析rrs基因，以美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫公布的rrs基因序列作為對(duì)照，進(jìn)行比對(duì)分析。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用“率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以絕對(duì)濃度法檢測(cè)結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，繪制MIC值診斷MDR-MTB菌株Am耐藥的受試者工作特征曲線(ROC曲線)，以取得最佳cut-off值。

結(jié) 果

1.耐藥情況：75株2005年分離的MDR-MTB菌株中對(duì)Am耐藥的有18株(24.0%，18/75)；在84株2015年分離的MDR-MTB菌株中有27株(32.1%，27/84)對(duì)Am耐藥，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.295，P>0.05)。

2.基因突變結(jié)果：對(duì)Am耐藥的菌株進(jìn)行rrs基因測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2005年18株對(duì)Am耐藥的MDR-MTB菌株均有A1401G突變(100.0%，18/18)，而2015年27株對(duì)Am耐藥的MDR-MTB菌株中有26株均有A1401G突變(96.3%，26/27)。此外，2005年6株(33.3%，6/18)菌株和2015年4株(14.8%，4/27)菌株同時(shí)攜帶T1384A突變(表1)。

表1 rrs基因突變?cè)诓煌瑫r(shí)間Am耐藥MDR-MTB

3.絕對(duì)濃度法與MABA法所測(cè)MIC值的比較：藥敏試驗(yàn)結(jié)果對(duì)Am敏感的菌株，對(duì)應(yīng)的MIC值主要集中在0.0625 μg/ml、0.125 μg/ml及0.25 μg/ml，分別占41.2%、28.9%和20.2%，三者共占90.3%(103/114)。藥敏試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)Am耐藥的菌株，有37.8%的MIC值≥64 μg/ml，見表2。

將MDR-MTB菌株的絕對(duì)濃度法藥敏試驗(yàn)結(jié)果與相應(yīng)MIC值繪制ROC曲線(圖1)，結(jié)果顯示：ROC曲線下面積為0.942，檢測(cè)Am耐藥的最佳cut-off值為1.5 μg/ml，對(duì)應(yīng)的敏感度為91.1%，特異度為98.2%。

圖1 MIC值診斷MDR-MTB菌株對(duì)Am耐藥的ROC曲線

討 論

MDR-MTB的感染及流行已成為全球結(jié)核病控制的難點(diǎn)。由于其對(duì)一線抗結(jié)核藥品的耐藥性，Am作為二線抗結(jié)核藥品在MDR-TB治療中得到了更廣泛應(yīng)用，但其耐藥性也隨之增高。本次研究顯示，2005年MDR-MTB分離株對(duì)Am的耐藥率為24.0%，而2015年則上升至32.1%。其原因可能是由于本次研究納入樣本量較小所致，后續(xù)有必要納入更多的MDR-MTB菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)。而本次研究發(fā)現(xiàn)的MDR-MTB菌株對(duì)Am的耐藥率高于摩洛哥(3.33%)、韓國(guó)(7.10%)、俄羅斯(17.5%)、沙特阿拉伯(2.40%)，以及我國(guó)山東省(17.07%)、蘇州地區(qū)(7.71%)及汕頭市(15.56%)[5-11]?？梢?，各地MDR-MTB菌株對(duì)Am的耐藥率不盡相同，國(guó)內(nèi)對(duì)Am的耐藥率也存在地域差異，且國(guó)內(nèi)的耐藥率高于國(guó)外。究其原因，首先，中國(guó)作為MDR-TB疫情最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，隨著相應(yīng)治療藥品的廣泛應(yīng)用，其耐藥情況勢(shì)必高于其他發(fā)達(dá)國(guó)家。同時(shí)，我國(guó)各地區(qū)經(jīng)濟(jì)水平及醫(yī)療技術(shù)水平不均衡發(fā)展是造成各地區(qū)結(jié)核病疫情及對(duì)藥品耐藥情況不同的重要原因。而本研究中的2005年和2015年的MDR-MTB對(duì)Am的耐藥率在國(guó)內(nèi)處于較高水平。這可能是由于筆者所在醫(yī)院作為結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院，難治、復(fù)治患者就診比例較高，反復(fù)治療使得患者總體耐藥情況比較嚴(yán)重。Am是治療MDR-MTB的核心藥品，國(guó)內(nèi)許多地區(qū)并沒有常規(guī)開展二線抗結(jié)核藥品的藥敏試驗(yàn)，僅憑經(jīng)驗(yàn)治療，其較高水平的耐藥率會(huì)增加患者治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)，加大結(jié)核病的診治難度。

Am屬于氨基糖苷類抗生素，但國(guó)內(nèi)外對(duì)其專項(xiàng)研究較少，目前對(duì)其產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制尚無全面的了解。通常認(rèn)為Am和Km的耐藥性是通過結(jié)合16S核糖體RNA的30S小核糖體亞基來抑制蛋白質(zhì)合成[12]，且16S rRNA的編碼基因rrs突變與Am的耐藥相關(guān)[13-14]。在本研究中，對(duì)Am耐藥的MDR-MTB菌株共45株，其中97.8%發(fā)生A1401G突變。此突變率低于格魯吉亞(100%)，高于美國(guó)(76.5%)、泰國(guó)(37.5%)和我國(guó)山東省(68.6%)報(bào)告的結(jié)果[10,15-17]?？梢姡珹1401G突變與Am耐藥性有較高的相關(guān)性。近期，WHO推薦將分子檢測(cè)技術(shù)在MDR-TB患者或耐利福平結(jié)核病(RR-TB)患者中應(yīng)用于對(duì)二線抗結(jié)核藥品的藥敏試驗(yàn)，以提高診斷的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果提示，在MDR-TB患者中開展對(duì)二線抗結(jié)核藥品的分子藥敏試驗(yàn)具有良好的效果。另外，還發(fā)現(xiàn)對(duì)Am耐藥的菌株同時(shí)存在A1401G和T1384A位點(diǎn)突變。目前，在相關(guān)研究中尚未發(fā)現(xiàn)T1384A位點(diǎn)突變的報(bào)道。但對(duì)Am敏感的MDR-MTB菌株進(jìn)行rrs測(cè)序分析，均未發(fā)生T1384A位點(diǎn)突變，考慮T1384A可能與Am耐藥相關(guān)，推測(cè)其可能與補(bǔ)償突變相關(guān)，具體意義有待進(jìn)行相關(guān)分子生物學(xué)研究以進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 MDR-MTB菌株對(duì)Am的藥敏試驗(yàn)結(jié)果在不同MIC值中的分布

本研究通過繪制MIC值判斷Am耐藥性的ROC曲線，模擬最佳cut-off值為1.5 μg/ml，高于此前WHO推薦的1 μg/ml。其原因可能是MABA方法檢測(cè)MIC值相較于表型藥敏試驗(yàn)，每孔的接菌量較大，此時(shí)參考WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)在一些相關(guān)研究中，也有報(bào)道MABA法檢測(cè)MIC值時(shí)參考WHO推薦的關(guān)鍵濃度并不準(zhǔn)確。有學(xué)者通過ROC曲線分析確定對(duì)Am耐藥的最佳判斷cut-off值為4 μg/ml[18]，以及氧氟沙星的耐藥折點(diǎn)濃度為2 μg/m[19]，均高于WHO推薦的1.5 μg/ml。可見，在使用MABA法檢測(cè)MIC時(shí)，使用WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確。但本研究結(jié)果尚處于初步階段，后續(xù)還需要通過擴(kuò)大檢測(cè)的樣本量來進(jìn)一步修正MIC判讀臨界值。