馬巖 楊曉軍 任振娟 蘇云開

結(jié)核病依然是嚴重影響全球公共衛(wèi)生的傳染性疾病之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織[1]報道，2018年中國耐多藥/利福平耐藥患者約為6.6萬例，占全球耐多藥/利福平耐藥患者的14%，是全球耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的高負擔國家之一。內(nèi)蒙古自治區(qū)是耐多藥結(jié)核病的高負擔地區(qū)，涂陽肺結(jié)核的耐多藥率為16.88%，遠高于全國的平均水平(8.32%)；特別是復(fù)治肺結(jié)核患者的耐多藥率高達70.13%，提示本地區(qū)耐多藥結(jié)核病疫情非常嚴峻[2]。

早期診斷耐藥結(jié)核病是遏制其傳播的重要手段。由于結(jié)核分枝桿菌(MTB)生長緩慢，傳統(tǒng)的表型藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)至少需1～3個月才能獲得診斷結(jié)果[3-5]。迫切需要快速診斷耐藥結(jié)核病、特別是耐多藥結(jié)核病的檢測技術(shù)，以改善公共衛(wèi)生狀況[1,6-7]。分子藥敏試驗的應(yīng)用顯著縮短了耐藥結(jié)核病的診斷時間，且具有更好的生物安全性，因此在不同層級實驗室得到推廣應(yīng)用?；蛐酒ú捎靡环N基于多重PCR和反向雜交的基因芯片耐多藥試劑盒[8]。一項研究報告了該試劑盒的性能，與傳統(tǒng)表型藥敏試驗方法相比，對利福平耐藥的敏感度和特異度分別為83.7%和98.7%，對異煙肼耐藥的敏感度和特異度分別為79.9%和99.6%，檢測MDR-TB的敏感度和特異度分別為74.1%和99.8%[9]；提示基因芯片法檢測MDR-TB的性能良好。本研究的目的是評價內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院結(jié)核病實驗室利用基因芯片法檢測肺結(jié)核患者痰標本診斷MDR-TB的性能，以評估基因芯片法檢測在診斷MDR-TB方面的臨床應(yīng)用價值。

資料和方法

一、研究設(shè)計

2019年6月1日至12月31日連續(xù)納入內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院收治的所有涂陽肺結(jié)核患者，每例患者提供2～3份痰標本，每份標本≥2 ml。本院結(jié)核病參比實驗室選取同一份痰標本同時進行傳統(tǒng)表型藥敏試驗(羅氏比例法藥敏試驗)和分子藥敏試驗(基因芯片法)檢測。本研究經(jīng)過內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院倫理委員會的批準(批準號：20200002)。

二、患者納入

本研究連續(xù)納入295例涂陽肺結(jié)核患者，包括住院和門診患者?；颊呷虢M標準：(1)實驗室痰涂片檢測陽性的患者；(2)年齡≥18歲；(3)患者簽署知情同意書。

所有進行羅氏比例法藥敏試驗的標本中， 25份培養(yǎng)陰性(8.5%，25/295)和8份培養(yǎng)污染(2.7%，8/295)，在進行羅氏比例法藥敏試驗和經(jīng)MPB64進行菌種鑒定時，有10份(3.4%，10/295)菌種鑒定結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌，另有13份(4.4%，13/295)標本羅氏比例法藥敏試驗結(jié)果檢測失敗，而具有藥敏試驗結(jié)果的239例患者中，4例患者痰標本基因芯片檢測結(jié)果中未檢測到結(jié)核分枝桿菌，因此最后用于羅氏比例法藥敏試驗結(jié)果分析的患者為235例。

痰標本所含結(jié)核分枝桿菌的陽性級別會影響基因芯片的檢測結(jié)果[10]。本研究基因芯片法檢測痰標本結(jié)果中，未檢測到結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、無法判讀結(jié)果的標本例數(shù)分別為13例、10例，5例，分別占總檢測標本的4.4%、3.4%和1.7%，可用于分析基因芯片法檢測結(jié)果的267例患者中，19例患者羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果為陰性，13例患者羅氏比例法表型藥敏試驗結(jié)果失敗，因此最后用于基因芯片法結(jié)果分析的患者為235例。

三、 儀器和培養(yǎng)基

基因芯片法檢測系統(tǒng)和結(jié)核分枝桿菌耐多藥基因芯片法檢測試劑盒購自北京博奧生物有限公司，羅氏培養(yǎng)基及羅氏比例法藥敏試驗培養(yǎng)基(羅氏含藥藥敏試驗培養(yǎng)基中異煙肼終濃度為0.2 μg/ml,利福平終濃度為40 μg/ml)購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

四、實驗室方法

使用N-乙酰半胱氨酸和氫氧化鈉溶液(NALC-NaOH)消化一份陽性級別較高的痰標本,盡快將痰樣本消化液接種于改良的酸性羅氏培養(yǎng)基斜面，37 ℃ 培養(yǎng)3周左右，再刮取菌落并按照文獻[5]的要求進行傳統(tǒng)表型藥敏試驗和菌種鑒定。

吸取1.2 ml消化后的樣品，加入1.5 ml離心管中，然后以離心半徑16 cm，12 000 r/min離心15 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，然后再以離心半徑16 cm,12 000 r/min離心5 min，最后按照公司提供的說明書進行基因芯片操作[10]。

內(nèi)蒙古自治區(qū)第四醫(yī)院結(jié)核病參比實驗室的工作人員均通過國家結(jié)核病參比實驗室培訓(xùn)和認可。在本研究開始之前，已進行了2個月的試運行，以確保參與本研究的實驗室人員能夠熟練操作基因芯片耐藥檢測技術(shù)。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 15.0統(tǒng)計學(xué)軟件對本研究的數(shù)據(jù)進行整理分析。統(tǒng)計不同陽性級別樣本中檢測結(jié)果包括正常、無法判斷和無分枝桿菌，采用Mantel-Haenszel卡方檢驗分析痰標本中結(jié)核分枝桿菌陽性級別與有無結(jié)果是否存在線性關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基因芯片檢測利福平耐藥性的效能評價

231例患者的羅氏比例法藥敏試驗結(jié)果和基因芯片法檢測結(jié)果一致，一致率為98.3%；利福平羅氏比例法藥敏試驗結(jié)果耐藥的23例患者中，基因芯片法檢測結(jié)果為耐藥22例，敏感度為95.7%(22/23)；利福平羅氏比例法藥敏試驗結(jié)果為敏感的212例中，基因芯片法檢測結(jié)果為敏感209例，特異度為98.6%(209/212)；此外，基因芯片法檢測利福平耐藥性的陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為88.0%(22/25)和99.5%(209/210) (表1)。

二、基因芯片檢測異煙肼耐藥性的效能評價

228例患者羅氏比例法藥敏試驗結(jié)果和基因芯片法檢測結(jié)果一致率為97.0%(228/235);異煙肼羅氏比例法藥敏試驗結(jié)果耐藥的20例患者中，基因芯片法檢測結(jié)果為耐藥者16例，敏感度為80.0%(16/20);異煙肼羅氏比例法藥敏試驗結(jié)果敏感的215例患者中，基因芯片法檢測結(jié)果為敏感的212例患者，特異度為98.6%(212/215)?；蛐酒z測異煙肼耐藥性的陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為84.2%(16/19)和98.1%(212/216) (表1)。

三、基因芯片法檢測耐多藥肺結(jié)核的效能評價

同時具有羅氏比例法藥敏試驗和基因芯片法檢測結(jié)果的235例患者中， 224例患者羅氏比例法藥敏試驗和基因芯片法檢測耐多藥的一致率為95.3%(224/235)。在羅氏比例法藥敏試驗診斷的21例耐多藥肺結(jié)核患者中，基因芯片法檢測結(jié)果為耐多藥肺結(jié)核患者16例，敏感度為76.2%(16/21)；羅氏比例法藥敏試驗診斷為非耐多藥肺結(jié)核的214例患者中，基因芯片法檢測為非耐多藥肺結(jié)核的患者208例，特異度為97.2%(208/214)?；蛐酒z測耐多藥肺結(jié)核患者的陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為72.7%(16/22)和97.7%(208/213)(表1)。

四、痰標本中結(jié)核分枝桿菌陽性級別對基因芯片法檢測結(jié)果的影響

標本中結(jié)核分枝桿菌陽性級別(陽性等級)[5]表示標本中結(jié)核分枝桿菌濃度的水平，可能對基因芯片的結(jié)果產(chǎn)生影響。分析結(jié)果表明，隨著標本陽性級別的提高，無結(jié)果構(gòu)成比不斷降低，其中“實際條數(shù)”和“++++”標本中無結(jié)果構(gòu)成比分別為20.0%和1.5%；有無結(jié)果與標本陽性級別之間存在線性關(guān)系，隨著標本陽性級別上升，無結(jié)果構(gòu)成比呈下降趨勢(R=7.971，P<0.01)(表2)。

討 論

一、基因芯片法檢測耐藥肺結(jié)核的效能評價

基因芯片可檢測痰標本中結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性相關(guān)基因[11]，特別是該方法可以直接檢測痰及其他臨床樣本。與傳統(tǒng)藥敏試驗相比，基因芯片法檢測具有諸多優(yōu)點。首先，基因芯片法檢測時間更短，一般在6 h內(nèi)可完成全部檢測過程，因此可為臨床醫(yī)生及時制定有效的結(jié)核病治療方案節(jié)省時間；其次，本方法是檢測結(jié)核分枝桿菌核酸，而非直接對結(jié)核分枝桿菌的操作，因此，基因芯片法比羅氏比例法藥敏試驗更安全；最后，基因芯片法檢測樣本通量較高，可節(jié)省實驗室工作人員的時間[12]。

表1 以羅氏比例法藥敏試驗為參考標準評價基因芯片法對利福平和異煙肼耐藥性的診斷效能

表2 標本陽性級別對基因芯片法檢測結(jié)果的影響[例(構(gòu)成比，%)]

國內(nèi)開展基因芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性研究多針對結(jié)核分枝桿菌菌株的檢測，基于患者痰標本進行基因芯片法檢測的研究較少[12]。2019年一項在地(市)級結(jié)核病實驗室對基因芯片法檢測評估結(jié)果中，利福平耐藥性檢測的敏感度和特異度分別為89.0%和96.1%；對異煙肼耐藥性檢測的敏感度和特異度分別為80.2%和96.7%[13]。本研究結(jié)果與其結(jié)果相近，提示直接從痰標本開展基因芯片法檢測能夠快速準確發(fā)現(xiàn)利福平及異煙肼耐藥的患者，具有良好的臨床應(yīng)用價值。

二、基因芯片與同類檢測方法比較

基因芯片和線性探針都是通過反向雜交檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因的檢測技術(shù)，線性探針檢測利福平耐藥性總體敏感度和特異度分別為91.0%和98.0%，檢測異煙肼耐藥性的總體敏感度和特異度為80.0%和98.0%[14]，與本研究結(jié)果類似。這與兩種方法檢測的原理高度相似，且覆蓋的耐藥基因的數(shù)量及區(qū)域相似有關(guān)。但是本研究也發(fā)現(xiàn)，對于異煙肼耐藥性檢測敏感度約為80.0%，即20.0%的異煙肼耐藥患者并未攜帶katG基因和inhA基因突變，提示存在其他的異煙肼耐藥相關(guān)基因突變導(dǎo)致上述菌株產(chǎn)生對異煙肼的耐藥性。近期的一項基于我國異煙肼耐藥菌株的分子流行病學(xué)研究表明，有超過10%的異煙肼耐藥菌株攜帶oxyR-ahpC基因區(qū)域的突變[15]，鑒于此，建議在基因芯片及其他異煙肼耐藥檢測的分子生物學(xué)產(chǎn)品中將oxyR-ahpC基因納入到檢測靶標中，以提高基因芯片對于異煙肼耐藥性的診斷效能。

三、標本涂片陽性級別對基因芯片法檢測結(jié)果的影響分析

痰標本陽性級別是反映痰標本中結(jié)核分枝桿菌含量的有效指標，基因芯片基于對結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因擴增檢測，因此不同陽性級別的標本可能對其結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)隨著痰標本陽性級別的不斷降低，無結(jié)果的比例顯著提高，尤其是陽性級別為實際條數(shù)的標本，無結(jié)果占比高達20.0%，這個結(jié)果提示基因芯片法檢測對于痰標本為實際條數(shù)級別的標本檢測結(jié)果可能在實際臨床使用過程中需要慎重。同時該部分結(jié)果提示在部分高陽性級別的標本中發(fā)現(xiàn)無檢測結(jié)果的情況，其中陽性級別為“++++”的標本中檢測無結(jié)果者的占比為1.5%，這可能是由于該陽性級別的部分標本為血痰或者干酪樣痰，該類痰中蛋白含量較高，可抑制基因芯片的擴增反應(yīng)，從而影響了結(jié)果的可讀性。然而，標本的陽性級別對診斷結(jié)果的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值方面的影響不大，表明基因芯片法檢測所獲得的結(jié)果具有較高的準確性。

根據(jù)之前的文獻提示，大約90%的耐利福平結(jié)核病患者對異煙肼也有耐藥性[16]。換言之，90%的耐利福平結(jié)核病患者患有耐多藥結(jié)核病。因此，對利福平是否耐藥被用于診斷耐多藥結(jié)核病的標志物[15-16]。在本研究中，有76.2%(16/21)對利福平耐藥的結(jié)核病患者對異煙肼耐藥，上述結(jié)果與近期的一項來自我國的薈萃分析結(jié)果類似[17]，提示在我國采用對利福平是否耐藥用于耐多藥結(jié)核病的診斷可能導(dǎo)致近1/4的患者失去使用異煙肼的機會，建議對利福平耐藥的患者同時開展對異煙肼是否耐藥的檢測，以明確耐多藥結(jié)核病的診斷。

本研究表明，基因芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平和異煙肼的耐藥性具有較高的敏感度和特異度。在實驗室條件允許的情況下，筆者認為痰標本基因芯片法檢測耐多藥肺結(jié)核與羅氏比例法藥敏均具有較高的臨床診斷價值，而基因芯片法是一種更有效、快速、安全、成本-效益更高的替代技術(shù)，是一種可在我國結(jié)核病實驗室進行耐藥性檢測的備選方法。