諶素素， 曹育春， 張 勇△

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科，武漢 430030 2武漢友芝友生物制藥有限公司，武漢 430075

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是一種由人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染引起的性傳播性疾病，臨床表現(xiàn)以疣狀病變?yōu)橹?。CA常發(fā)生于外生殖器及肛周，絕大多數(shù)通過(guò)性傳播方式感染，臨床上表現(xiàn)為贅生物[1-2]。目前公認(rèn)CA高復(fù)發(fā)與全身及局部免疫抑制狀態(tài)有直接關(guān)系，但具體的免疫抑制機(jī)制不是十分明確，對(duì)此國(guó)內(nèi)外研究者一直在努力探索。我們課題組對(duì)此亦做了一些研究，發(fā)現(xiàn)Foxp3+Treg介導(dǎo)了CA局部免疫抑制狀態(tài)[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Foxp3+Treg胞內(nèi)的ATP水平低于其它T淋巴細(xì)胞亞群，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽介導(dǎo)的氧化還原系統(tǒng)分解毒性物質(zhì)依賴(lài)ATP，因而對(duì)環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物的毒性很敏感。環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑多用于結(jié)締組織病及腫瘤化療患者，但低劑量環(huán)磷酰胺有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用[4]。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)低劑量環(huán)磷酰胺可選擇性地消減Foxp3+Treg細(xì)胞，而其它T細(xì)胞亞群不受影響[5]。臨床用低劑量環(huán)磷酰胺能改善CA局部細(xì)胞免疫功能，有效治療并阻止CA復(fù)發(fā)[5-6]。由此建立了環(huán)磷酰胺治療CA的“間歇、短程、低劑量”給藥方法[即：環(huán)磷酰胺1 mg/(kg·d)，連續(xù)服藥7 d停3 d為1療程，共3～6療程]，經(jīng)臨床治療證實(shí)，該療法可有效治療CA并顯著降低患者的復(fù)發(fā)率，同時(shí)費(fèi)用低，毒副作用不明顯[6-7]。胸腺肽具有提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能的作用[8]，我們也曾用低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽治療CA取得較好的臨床療效[9]。為充分改善患者免疫狀態(tài)，擬定了“低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽治療CA”療法。

以上僅僅從免疫學(xué)角度奠定了該療法的理論基礎(chǔ)，但其具體作用的分子機(jī)制并不明確。CA的主要特征性病理改變?yōu)楸砥こ嗜轭^瘤樣增生，增生的棘層上方可見(jiàn)不同數(shù)量的“挖空細(xì)胞”。前期經(jīng)該療法治療1個(gè)月后的CA患者，顯示較多病例的疣體縮小，甚至完全消退。為初步探討該療法的分子機(jī)制，結(jié)合其病理改變，本研究以該療法治療1個(gè)月后有效病例為研究對(duì)象，主要探討治療前后疣體組織在增殖與凋亡層面的變化。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年9月至2017年12月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科門(mén)診就診的初次發(fā)病CA患者：年齡18～65歲；有典型皮損，皮損檢測(cè)HPV6/11-DNA(+)；就診前4周內(nèi)未接受過(guò)局部或全身免疫調(diào)節(jié)劑治療；無(wú)環(huán)磷酰胺藥物使用禁忌。所有患者治療前簽署知情同意書(shū)。服用低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽治療1個(gè)月后，收集到符合條件患者55人，其中男性30例，女性25例。療效判定標(biāo)準(zhǔn)：①完全緩解：皮損完全消退；②大部分緩解：皮損數(shù)量消退50%以上或面積縮小50%以上；③小部分緩解：皮損數(shù)量消退50%以下或面積縮小50%以下；④無(wú)反應(yīng)：皮損無(wú)變化或增大、增多。

1.2 治療方法

復(fù)方環(huán)磷酰胺片(泰魁，通化茂祥制藥有限公司)1 mg/(kg·d)，服藥7 d停3 d為1個(gè)療程，連續(xù)3個(gè)療程；胸腺肽腸溶片(迪賽，西安迪賽生物藥業(yè)有限責(zé)任公司)30 mg/次，2次/d，服藥30 d。治療結(jié)束后針對(duì)疣體消退程度采取對(duì)應(yīng)后續(xù)治療：①皮損完全消退患者繼續(xù)該療法1～3療程；②皮損大部分緩解和小部分緩解患者予以激光去除疣體，同時(shí)繼續(xù)該療法1～3療程；③無(wú)反應(yīng)患者視為該療法無(wú)效，予以停藥，給予激光去疣或其他治療。

1.3 標(biāo)本采集及預(yù)處理

患者服藥前及服藥1個(gè)月后皮損取材，采用PCR測(cè)定HPV 6/11-DNA，檢測(cè)過(guò)程在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一進(jìn)行。手術(shù)切取患者治療前后的疣體各1枚進(jìn)行石蠟包埋，制作石蠟切片。

1.4 試劑與儀器

Cleaved Caspase-3抗體(兔，1∶100，三鷹生物技術(shù)有限公司)，Ki-67抗體(鼠，1∶200，三鷹生物技術(shù)有限公司)，HPV 6/11-DNA原位雜交試劑盒[泰普生物科學(xué)(中國(guó))有限公司]。

1.5 檢測(cè)方法

用隨機(jī)數(shù)字表法選取符合療效標(biāo)準(zhǔn)中的“大部分緩解”17例及“小部分緩解”3例共20例患者相應(yīng)標(biāo)本。①免疫組化ABC法檢測(cè)Cleaved Caspase-3和Ki-67：石蠟切片脫蠟及水化，組織抗原修復(fù)，添加一抗(Cleaved Caspase-3，Ki-67)，滴加二抗(1%BSA)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水及透明，樹(shù)脂封片。②原位雜交檢測(cè)HPV6/11-DNA：石蠟切片脫蠟及水化，雜交預(yù)處理，雜交，DAB顯色脫水及透明，樹(shù)脂封片。

1.6 陽(yáng)性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，按陽(yáng)性細(xì)胞比例計(jì)分：未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞者評(píng)定為0分，陽(yáng)性細(xì)胞比例<25%者評(píng)定為1分，陽(yáng)性細(xì)胞比例25%～75%者評(píng)定為2分，陽(yáng)性細(xì)胞比例>75%者評(píng)定為3分；按顯色深淺計(jì)分：不顯色或顯色模糊者評(píng)定為0分，淺黃色者評(píng)定為1分，棕黃色者評(píng)定為2分，棕褐色者評(píng)定為3分；以上述二者之和判定結(jié)果：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～5分為中度陽(yáng)性()，>5分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

20例患者皮損處PCR定量檢測(cè)HPV6/11-DNA，結(jié)果統(tǒng)計(jì)后輸入Graphpad Prism 6軟件，經(jīng)t檢驗(yàn)分析治療前后HPV拷貝數(shù)差異，以P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽治療CA有效病例的篩選結(jié)果

該療法治療1個(gè)月后，按時(shí)復(fù)診的CA患者共計(jì)55人，其中皮損完全緩解14人，占比例為25.5%；大部分緩解30人，占比例為54.5%(大部分緩解的典型病例見(jiàn)圖1)；小部分緩解6人，占比例為10.9%；無(wú)反應(yīng)5人，占比例為9.1%。

2.2 治療前后疣體KCs中的增殖指標(biāo)Ki-67及凋亡指標(biāo)Cleaved Caspase-3的表達(dá)情況

隨機(jī)數(shù)字表法選出20例治療有效的CA患者，免疫組化檢測(cè)該療法治療前后CA患者局部增殖指標(biāo)Ki-67及凋亡指標(biāo)Cleaved Caspase-3。圖2顯示3例患者的檢測(cè)結(jié)果，Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞多數(shù)為核著色，呈棕黃色，少數(shù)為胞質(zhì)弱染色。Cleaved Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)于胞質(zhì)。20例患者治療前后疣體角質(zhì)形成細(xì)胞(KCs)中Ki-67陽(yáng)性表達(dá)情況：治療前Ki-67陽(yáng)性表達(dá)多為陽(yáng)性()或強(qiáng)陽(yáng)性()，治療后表達(dá)多為陰性或弱陽(yáng)性(+)(表1)，比較治療前后陽(yáng)性表達(dá)率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。20例患者治療前后疣體KCs中Cleaved Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)情況：治療前Cleaved Caspase-3的表達(dá)多在(-)～()，治療后表達(dá)多為()～()(表2)，比較治療前后陽(yáng)性表達(dá)率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽治療CA患者治療前后皮損變化Fig.1 Images of lesion changes from two representative patients of CA before and after low-dose cyclophosphamide combined with thymosin treatment

圖2 免疫組化檢測(cè)治療前后KCs中Ki-67及Cleaved Caspase-3的表達(dá)(×100)Fig.2 Ki-67 and Cleaved Caspase-3 expression by immunohistochemistry before and after treatment(×100)

表1 治療前后疣體KCs中Ki-67的表達(dá)Table 1 Ki-67 expression in KCs of warts before and after treatment

表2 治療前后疣體KCs中Cleaved Caspase-3的表達(dá)Table 2 Cleaved Caspase-3 expression in KCs of warts before and after treatment

2.3 治療前后疣體內(nèi)HPV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的變化及疣體表面HPV載量的變化

用HPV6/11原位雜交方法顯示該療法治療前后疣體內(nèi)HPV的變化。結(jié)果顯示：治療前棘層細(xì)胞核及胞質(zhì)、顆粒層細(xì)胞內(nèi)均有明顯的表達(dá)，而治療后主要是棘層細(xì)胞的胞核表達(dá)。治療后表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少(典型病例的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化見(jiàn)圖3)；治療后疣體表面HPV6/11-DNA的實(shí)時(shí)定量PCR病毒載量明顯低于治療前(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖3 治療前后疣體內(nèi)HPV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的變化Fig.3 The changes of HPV positive cell expression in warts before and after treatment

圖4 治療前后疣體內(nèi)HPV病毒載量的變化Fig.4 The changes of HPV DNA copies in warts before and after treatment

3 討論

《尖銳濕疣診療指南(2014)》及最新的《尖銳濕疣治療專(zhuān)家共識(shí)(2017)》均明確指出：CA治療的基本原則是盡早去除疣體，改善癥狀，盡可能消除疣體周?chē)鷣喤R床感染和潛伏感染，減少?gòu)?fù)發(fā)[10-11]。在CA的治療過(guò)程中，如僅使用物理治療，其6個(gè)月內(nèi)的復(fù)發(fā)率超過(guò)67%。因此目前CA的主流治療方案是物理治療清除疣體，再結(jié)合藥物治療抑制其復(fù)發(fā)，其復(fù)發(fā)率可降至20%左右。但整個(gè)治療過(guò)程繁瑣，費(fèi)用較高，患者需多次承受物理治療的痛苦。探尋安全、有效治療CA并阻止其復(fù)發(fā)的新方法，同時(shí)對(duì)其機(jī)制加以闡明，對(duì)該疾病的診療具有重要的臨床價(jià)值。

本研究首先用低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽治療CA患者55例，用自身前后對(duì)照的方法發(fā)現(xiàn)其中50例有臨床療效，除皮損完全消退的14例外，我們從剩余36例有效病例中按照隨機(jī)數(shù)字表法選取20例患者的小樣本，進(jìn)一步探討該療法治療CA的作用機(jī)制是否與影響?zhàn)囿wKCs的增殖和凋亡有關(guān)。

Ki-67蛋白是一組與細(xì)胞增殖有關(guān)的非組核蛋白，在細(xì)胞周期的G1期、S期、G2期、M期均有表達(dá)，但在靜息細(xì)胞(G0)中不表達(dá)或低表達(dá)，因此，Ki-67蛋白與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，常被作為細(xì)胞增殖標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，CA患者Ki-67除基底層有表達(dá)外，在那些沒(méi)有分化能力的上層表皮結(jié)構(gòu)亦有不同程度的表達(dá)，說(shuō)明當(dāng)HPV感染宿主細(xì)胞時(shí)，KCs增殖周期發(fā)生紊亂，表現(xiàn)在除有分化能力的KCs，那些沒(méi)有分化能力的KCs亦有異常的增殖。我們對(duì)20例患者治療前后疣體組織中的KCs增殖指標(biāo)Ki-67表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽治療后Ki-67表達(dá)減少，提示該療法治療后疣體中KCs增殖能力降低，HPV感染后的KCs異常增殖狀態(tài)得到有效抑制。臨床上表現(xiàn)為CA疣體縮小或減少。

參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的主要酶家族為Caspase，Caspase-3被激活后剪切產(chǎn)生活性片段Cleaved Caspase-3，這將激活半胱氨酸蛋白酶的粒酶B引入殺傷性T細(xì)胞，導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡。所以，Caspase-3在凋亡過(guò)程中起主導(dǎo)作用，這也是我們選取Cleaved Caspase-3作為細(xì)胞凋亡觀察指標(biāo)的原因。該療法治療后顯示Cleaved Caspase-3表達(dá)增加，提示環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽治療后疣體病理性增殖形成的KCs凋亡增加，加速向終末細(xì)胞分化，在角質(zhì)層脫落死亡。

CA疣體局部中HPV病毒大量存在于棘層上部和顆粒層中的挖空細(xì)胞中，而在基底層中HPV含量很低[12]。HPV顆粒在感染表皮基底層細(xì)胞后，隨著基底層細(xì)胞向上分化增殖的過(guò)程大量復(fù)制增殖，造成患處局部疣體形成。用原位雜交方法對(duì)治療前后疣體內(nèi)HPV病毒的變化及疣體表面HPV載量的變化進(jìn)行探討，結(jié)果顯示治療后疣體內(nèi)HPV陽(yáng)性細(xì)胞減少。進(jìn)一步用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)治療前后患者疣體表面HPV6/11-DNA拷貝數(shù)，結(jié)果顯示治療后病毒載量明顯低于治療前。接觸CA患者是否發(fā)病，很大程度上取決于接觸者感染的病毒量。HPV表達(dá)的部分蛋白對(duì)局部細(xì)胞免疫有抑制作用，高載量的HPV對(duì)局部細(xì)胞免疫抑制作用相對(duì)較強(qiáng)，使機(jī)體難以抑制病毒復(fù)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示治療后病毒載量明顯低于治療前，提示低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽治療能通過(guò)解除局部細(xì)胞的免疫抑制，有效清除HPV病毒。Che等[13]發(fā)現(xiàn)病毒載量隨著復(fù)發(fā)次數(shù)以及病程的增加而升高，因此對(duì)于高載量病毒的患者，應(yīng)早期進(jìn)行綜合治療，盡可能降低病毒載量，這也與我們使用低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽治療CA的思路一致。

基于以上研究結(jié)果顯示的治療后Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率下降，表達(dá)強(qiáng)度減弱，Cleaved Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率升高，表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)以及治療后病毒載量下降，我們可以得出如下結(jié)論：該療法治療有效的機(jī)制與疣體中KCs增殖能力降低、凋亡增強(qiáng)及疣體HPV載量減少相關(guān)。這為低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽療法治療CA臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。提示今后對(duì)低劑量環(huán)磷酰胺聯(lián)合胸腺肽療法治療CA機(jī)制的進(jìn)一步研究，既可以聚焦于疣體中KCs的增殖與凋亡的具體分子機(jī)制，也可以聚焦于疣體內(nèi)HPV載量減少的具體分子機(jī)制上。