王俊，張棟，陳晴晴，俞俊嶺，楊奕，喬亮，孫永*

冠狀病毒屬套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus），是自然界廣泛存在的能夠感染人和動物的一大類病毒家族。系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，冠狀病毒可分為：α、β、γ、δ四個屬，其中β屬冠狀病毒又可分為A、B、C、D四個亞群。由2019新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是目前被鑒別的第7種可以感染人的冠狀病毒［1］。SARS-CoV-2為β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm，基因組為一條完整的單股正鏈RNA［2］。

SARS-CoV-2引起的肺炎，對全球公共衛(wèi)生體系構(gòu)成了巨大的威脅。截止到2020-05-09，全球范圍內(nèi)報道的確診病例已經(jīng)超過四百萬例，死亡276 473例［3］。因此建立SARS-CoV-2快速、準確的鑒別手段，對于治療方法的選擇、挽救生命和防止疾病蔓延具有十分重要的意義?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案（試行第七版）》［2］指出：SARS-CoV-2的病原學檢查推薦采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time PCR）和/或高通量測序（NGS）方法，但一直以來，核酸提取和檢測過程中，假陰性和假陽性情況也是不爭的事實，國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心在全國31個省份（含自治區(qū)、直轄市）開展的新型冠狀病毒核酸檢測室間質(zhì)量評價也證實了這一點［4］。

20世紀80年代出現(xiàn)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)［5］，在核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子檢測方面的研究，極大地推動了基因組學和蛋白組學的發(fā)展，而對于PCR-核酸飛行時間質(zhì)譜（PCR-TOF MS）的應用主要集中在多重單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點［6］的基礎(chǔ)上。PCR-TOF MS檢測方法結(jié)合多重PCR技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)，對延伸后的不同片段的核酸序列進行分子量檢測，無須進行熒光信號的采集，同時，PCRTOF MS系統(tǒng)還可檢測出延伸探針與延伸產(chǎn)物之間只有一個堿基的分子量差異，其檢測范圍在1 000～10 000 Da［7］。因此可通過設計SNP位點，從而達到中等通量檢測的目的。

本研究價值:

本研究應用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）原理，在Clin-ToF-Ⅱ飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)上，建立聚合酶鏈反應（PCR）-飛行時間質(zhì)譜檢測新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的方法，并通過對COVID-19疑似患者的核酸樣本進行檢測，評價檢測性能及實際應用價值。

本研究主要結(jié)果及結(jié)論:

PCR-核酸飛行時間質(zhì)譜方法可應用于SARSCoV-2核酸檢測，有較好的特異度和靈敏度，樣本檢出率高于實時熒光定量PCR方法，尤其對實時熒光定量PCR報告疑似樣本有較高的陽性率，可明確判斷結(jié)果，且檢測成本低。PCR-核酸飛行時間質(zhì)譜的應用主要集中在多重單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點的基礎(chǔ)上，該方法在疑似樣本檢測中有較好的優(yōu)勢，在新型冠狀病毒檢測方法建立方面為首次報道，為避免病例樣本假陰性提供了補充，具有廣闊的應用前景。

基于上述研究基礎(chǔ)以及MALDI-TOF MS技術(shù)在核酸檢測方面的優(yōu)勢，本文擬采用Clin-ToF Ⅱ飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)建立SARS-CoV-2 PCR-TOF MS系統(tǒng)的檢測方法，并通過對COVID-19疑似患者的核酸樣本進行檢測，評價其檢測性能，旨在為SARS-CoV-2檢測提供一種可選擇的檢測技術(shù)手段，提高檢測效率，減少檢測成本，更好地輔助臨床診斷。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)及樣本來源 建立數(shù)據(jù)來源方法：收集2020年2—3月上海市臨床檢驗中心室間質(zhì)評陽性樣本40份、陰性樣本7份，國家衛(wèi)健委室間質(zhì)評陽性樣本41份、陰性樣本33份，本實驗室購買陽性質(zhì)粒及稀釋樣本32份，健康人樣本28份，空白對照超純水5份。陽性樣本共113份，陰性樣本共68份，空白對照樣本5份，總樣本數(shù)為186份。

評估樣本來源方法：本課題組于2020年1—2月留存安徽省內(nèi)臨床送檢到安徽省疾病預防控制中心的疑似COVID-19患者上呼吸道樣本80份，其中咽拭子樣本55份，痰液樣本25份。健康人群樣本20份，均為咽拭子樣本。

1.2 儀器與試劑

隨著改革開放的春風吹遍祖國大地，我的居住條件也發(fā)生了翻天覆地的變化，我從祖輩們住了許多年的鄉(xiāng)間搬到了縣城里，偶爾還會想起那只受過傷的黑鳥，也不知道它現(xiàn)在在哪里？還會像從前一樣來看看我嗎……

1.2.1 儀器 飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)：Clin-ToF Ⅱ（北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司）；實時熒光定量PCR儀：ABI-7500型（美國應用生物系統(tǒng)公司）；PCR擴增儀：MJ-PTC-200（美國BIORAD公司）；全自動核酸提取儀：SLA-E13200（臺灣圓點奈米技術(shù)股份有限公司）。

1.2.2 試劑 SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒（微陣列芯片-飛行時間質(zhì)譜法，北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司）；熒光定量PCR試劑（上海伯杰醫(yī)療科技有限公司）；磁珠法核酸提取試劑（臺灣圓點奈米技術(shù)股份有限公司）；開放讀碼框 1ab（open reading frame，ORF1ab）基因和核殼蛋白（nucleoprotein，N）基因陽性質(zhì)?！采ど锕こ蹋ㄉ虾＃┕煞萦邢薰尽场?/p>

1.3 研究方法

1.3.1 樣本核酸提取 （1）提取原理：磁珠提取純化技術(shù)，轉(zhuǎn)移磁珠時使用一次性磁套，避免交叉污染。（2）取出試劑盒中的試劑盤，小心移除鋁箔膜。（3）取200 μl樣本加至裂解液中靜止5 min，至試劑盤欄位#1/#7內(nèi)。（4）將試劑盤完全推至機器導槽底，并確定試劑盤的缺角面向門板。（5）將攪拌套推至攪拌套的導槽底。（6）關(guān)上門板，選擇程序“VIRUS-40-5”。（7）程序結(jié)束后，蜂鳴器鳴叫。小心取出試劑盤。（8）利用微量吸管將純化的核酸從欄位#6/#12移至干凈的離心管中。（9）將使用過的試劑盤和攪拌套置于污染廢棄物回收桶內(nèi)。

1.3.2 樣本核酸實時熒光定量PCR檢測 （1）試劑盒采用實時熒光定量PCR技術(shù)，以SARS-CoV-2的ORF1ab基因、N基因設計特異性引物和TaqMan探針，通過實時熒光定量PCR儀進行擴增，從而實現(xiàn)對SARS-CoV-2核酸的檢測。（2）從試劑盒中取出核酸擴增反應液、酶混合液、ORF1ab/N反應液，室溫融化，充分振蕩混勻后瞬間離心（2 000 r/min 離心 15 s，離心半徑為11 cm）。計算試劑使用份數(shù)（N=樣本數(shù)+1管陽性對照+1管陰性對照），配置反應體系，加入適當體積離心管中，充分振蕩混勻后瞬間離心，按20 μl分裝至PCR反應管中，并轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。（3）在上述準備好的PCR反應管中分別加入待測樣本核酸及試劑盒配套陽性對照和陰性對照各5 μl，樣本核酸由咽拭子、痰液等樣本提取得到，終體積為25 μl/管，蓋緊管蓋，瞬時離心。（4）將配置好的PCR反應管置于實時熒光定量PCR儀擴增檢測。（5）儀器運行結(jié)束后對實驗結(jié)果分析，利用受試者工作特征曲線（ROC曲線）法確定ORF1ab基因、N基因參考值均為Ct值=38。

1.3.3 PCR-TOFMS技術(shù)的建立參考美國 Agena Bioscience核酸質(zhì)譜方法建立，檢測步驟包括：PCR擴增、蝦堿性磷酸酶（SAP）消化、延伸反應、純化和點樣以及飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)對微陣列芯片進行的信號讀取和判別，并對加入模版的量進行優(yōu)化。根據(jù)陽性質(zhì)粒質(zhì)譜峰的信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）值，形成判斷標準：（1）PCR擴增：按表1的比例取出各組分，進行PCR擴增反應液的配制，按照表2的反應程序進行PCR擴增。（2）SAP消化：按表3的比例取出各組分，進行SAP消化反應液的配制，按照表4的反應程序進行SAP消化反應。（3）延伸反應：按表5的比例取出各組分，進行延伸反應液的配制，延伸反應程序為94 ℃預變性30 s并循環(huán) 1 次，94 ℃變性 5 s、56 ℃退火 5 s并循環(huán) 5次、80 ℃延伸 5 s（共循環(huán) 40 次），72 ℃延伸 5 min 并循環(huán)1次，4 ℃終止反應。（4）純化：延伸反應完畢后，在產(chǎn)物分析區(qū)向每支PCR管/孔延伸產(chǎn)物中加入30 μl已混合好的濕樹脂，顛倒混勻 5 min，5 000 r/min 離心1 min，離心半徑為11 cm。（5）點樣：將純化后的純化產(chǎn)物點樣到微陣列芯片的基質(zhì)上。（6）上機檢測：使用飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)對微陣列芯片進行信號讀取和判別。

表1 PCR擴增反應體系Table1 PCR amplification reaction system

表2 PCR擴增反應熱循環(huán)程序Table 2 PCR amplification reaction thermal cycle program

1.3.4 樣本PCR-TOF MS檢測 選擇ORF1ab基因和N基因作為檢測靶標，對臨床疑似病例上呼吸道樣本（80份）和健康人群上呼吸道樣本（20份）進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。實時熒光定量PCR鑒定出的樣本陽性檢出率與陰性檢出率以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05表示質(zhì)譜峰落在區(qū)間比例的差異有統(tǒng)計學意義。

表3 SAP消化反應體系Table 3 SAP enzyme digestion reaction system

表4 SAP消化反應程序Table 4 SAP enzyme digestion reaction program

表5 延伸反應體系Table 5 Extension reaction system

2 結(jié)果

2.1 PCR-TOF MS判讀標準的確定及模版條件優(yōu)化

2.1.1 PCR-TOF MS判讀標準的確定 ORF1ab基因和N基因，經(jīng)PCR擴增、SAP消化和單堿基延伸后產(chǎn)生目標序列及其分子質(zhì)量如圖1所示。與其他檢測方法一樣，PCR-TOF MS在SARS-CoV-2檢測中應用的一個重要問題是對于結(jié)果的判讀。為此，以峰的SNR為指標，對186份樣本進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。取不同的Log10SNR閾值，計算靈敏度（實際陽性樣本中Log10SNR大于閾值所占的比例）和錯誤率（Log10SNR大于閾值的樣本中假陽性樣本所占的比例），如圖2所示。以N基因作為判定標準時，在 Log10SNR（N） = 0.5～1.2（暨 SNR（N）=3～16）的范圍內(nèi)，可以在達到較高靈敏度（＞90%）的同時維持低錯誤率（＜2%）。統(tǒng)計結(jié)果顯示，N基因和ORF1ab基因質(zhì)譜峰的SNR值在陽性樣本和陰性樣本之間的差異顯著（P＜0.05）。

當以任一基因的檢出作為評判標準時，接收者操作特征曲線（ROC曲線）下面積趨近于1，計算出的最佳門限值為5.5，SNR=3通常被認為是質(zhì)譜峰定性檢出的標準。由此，SNR≥6時為陽性判定標準，SNR在3～6時判定為疑似陽性，所有基因的SNR＜3時判定為陰性。以ORF1ab基因和N基因作為雙檢測靶標時，任何一個及以上陽性即判斷為陽性，均為陰性則判斷為陰性，單靶標及以上疑似陽性為疑似陽性。

圖1 典型陽性樣本質(zhì)譜圖Figure 1 Representative MALDI-TOFMS of SARS-CoV-2 positive samples

圖2 N基因和ORF1ab基因不同SNR閾值下SARS-CoV-2檢出靈敏度和錯誤率Figure 2 Detection error rate and sensitivity of SARS-CoV-2 under different SNR thresholds of N gene and ORF1ab Gene

2.1.2 PCR-TOF MS 模版條件優(yōu)化 PCR-TOF MS 分析以峰的SNR為指標，對10 copy/μl陽性質(zhì)粒的PCRTOF MS結(jié)果進行分析。ORF1ab基因和N基因，經(jīng)PCR擴增、SAP消化和單堿基延伸后產(chǎn)生目標序列及其分子質(zhì)量如圖2所示。3 μl質(zhì)粒模板時N基因和ORF1ab基因的UEP引物沒有消耗完全，模版至6 μl時，獲得典型質(zhì)譜圖，同時陰性對照無峰值出現(xiàn)，提示體系正常（見圖3）。

2.2 PCR-TOF MS與實時熒光定量PCR法檢測疑似樣本和健康人群樣本的結(jié)果比較 對80份疑似樣本及20份健康人群樣本的檢測結(jié)果分析顯示：PCR-TOF MS檢測出的陽性樣本數(shù)為72份，陽性檢出率為90.00%；而實時熒光定量PCR法檢測出的陽性樣本為60份，陽性檢出率為75.00%；但實時熒光定量PCR法存在25.00%（20/80）的可疑結(jié)果；PCR-TOF MS較實時熒光定量PCR法更加敏感且容易判斷，見表6。在所檢測的20份健康人群樣本中，PCR-TOF MS法與實時熒光定量PCR法完全一致，陰性檢出率均為100.00%（20/20）。

圖3 樣本質(zhì)譜圖Figure 3 Representative MALDI-TOFMS of SARS-CoV-2 samples

表6 PCR-TOF MS法與實時熒光定量PCR法檢測疑似樣本和健康人群樣本的結(jié)果比較〔n（%）〕Table 6 Comparison of PCR-TOFMS and real-time PCR in the detection of SARS-CoV-2 in samples of suspected COVID-19 cases and healthy people

2.3 PCR-TOF MS與實時熒光定量PCR法分別檢測疑似樣本咽拭子和痰液樣本的結(jié)果比較 通過對疑似樣本的55份咽拭子樣本及25份痰液樣本檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，實時熒光定量PCR法對痰液和咽拭子樣本的陽性檢出率分別為64.00%和43.64%，PCR-TOF MS法則分別為100.00%和85.45%，兩種檢測方法對痰液樣本的陽性檢出率均高于對咽拭子樣本的陽性檢出率。PCR-TOF MS法對痰液樣本陽性檢出率為100.00%，無可疑及陰性結(jié)果出現(xiàn)。由此可見，就SARS-CoV-2的樣本檢出率而言，痰液優(yōu)于咽拭子，見表7。

表7 PCR-TOF MS與實時熒光定量PCR法檢測疑似樣本中咽拭子樣本和痰液樣本的結(jié)果比較〔n（%）〕Table 7 Comparison of PCR-TOFMS and real-time PCR in the detection of SARS-CoV-2 in throat swab and sputum samples from suspected COVID-19 cases

3 討論

本研究采用的PCR-TOF MS法，其關(guān)鍵技術(shù)包括單堿基延伸技術(shù)、MALDI-TOF MS檢測技術(shù)。單堿基延伸技術(shù)是以PCR擴增產(chǎn)物為模版，以ddNTP為物料，使用單堿基延伸引物對待測位點進行單堿基延伸反應，即延伸引物只延伸一個堿基后立即終止。該技術(shù)又稱為“微測序技術(shù)”，具有測序技術(shù)的高準確性、高特異性等特點，同時，單堿基延伸技術(shù)與多重PCR擴增技術(shù)結(jié)合，使得目標片段產(chǎn)物量指數(shù)級擴大，明顯提高樣本的檢測靈敏度。飛行時間質(zhì)譜主要由兩部分組成：基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時間質(zhì)量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而檢測到不同離子的質(zhì)荷比（M/Z）。飛行時間質(zhì)譜檢測技術(shù)檢測核酸的本質(zhì)是對于離子的分子量檢測，具有準確、可靠、高效的特點，是一種新興的基因診斷方法，在臨床應用方面具有較大應用潛力，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已于2014年批準MALDITOF MS用于臨床核酸檢測。

本研究以質(zhì)譜峰的SNP為指標，通過對186份樣本結(jié)果的分析，確定了PCR-TOF MS用于SARS-CoV-2檢測的結(jié)果判讀標準。為了進一步驗證質(zhì)譜分析結(jié)果的判讀標準，其與實時熒光定量PCR法的檢測結(jié)果進行了對比。對80份疑似COVID-19病例樣本的檢測發(fā)現(xiàn)，PCR-TOF MS檢測方法對SARS-CoV-2的陽性檢出率明顯高于實時熒光定量PCR法，而假陰性率低于實時熒光定量PCR法。通過對20例健康人群樣本的檢測，兩種方法均無假陽性現(xiàn)象，同時需要指出的是，PCR-TOF MS檢測結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)灰區(qū)樣本，因此，該法與實時熒光定量PCR法相比，具有較高的靈敏度。

樣本的病毒含量、標本類型、試劑盒質(zhì)量、采樣方法、樣本運輸?shù)葐栴}均可能導致核酸檢測結(jié)果不準確，且容易出現(xiàn)“假陰性”現(xiàn)象，本研究通過對咽拭子和痰液標本的檢測結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)無論是實時熒光定量PCR法還是PCR-TOF MS法，疑似COVID-19病例的痰液樣本陽性檢出率明顯高于咽拭子樣本，且假陰性率低于咽拭子樣本，PCR-TOF MS法對疑似COVID-19病例痰液樣本的陽性檢出率甚至達到了100.00%，這與SARS-CoV-2易于在下呼吸道繁殖生長相吻合，提示樣本采集應盡量采集下呼吸道標本［8-9］。因此該方法應用于SARS-CoV-2檢測，作為實時熒光定量PCR的補充或協(xié)同，在一定程度上有利于彌補假陰性問題，降低漏診率。

PCR-TOF MS法是一種聯(lián)合多重PCR技術(shù)與飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的核酸檢測方法，檢測過程包括PCR擴增、SAP消化和單堿基延伸3個不同時長的PCR步驟，因此操作時間比實時熒光定量PCR法長，但遠低于二代測序法。操作過程中，多次開蓋也易造成標本間的交叉污染，因此應嚴格執(zhí)行PCR實驗室標準操作規(guī)范。

飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在應用方面不僅可以進行蛋白質(zhì)多肽檢測、微生物鑒定、糖基化檢測，同時還可以進行基因的SNP、突變、甲基化及拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）分析。在臨床檢測領(lǐng)域，其基因檢測的功能還未得到充分開發(fā)，但鑒于其靈敏度高、特異度高，檢測成本低、高通量和高準確性等特點，在核酸檢測方面具有廣闊的應用前景。

本檢測方法具有較高的靈敏度和特異度，在可疑樣本檢測確診中具有較好優(yōu)勢，但該方法需要飛行時間質(zhì)譜儀，硬件設備要求較高，不適合在縣區(qū)級的醫(yī)療機構(gòu)推廣應用。

在現(xiàn)有SARS-CoV-2臨床診斷及密切接觸者確診環(huán)節(jié)中，存在大量可疑樣本需要實驗室檢測的多次驗證，該方法的建立顯著提高了檢測效率，減少了實驗室重復驗證的過程，更早的提供了實驗證據(jù)，也為疫情研判縮短了時間。

作者貢獻：王俊進行文章的構(gòu)思與設計、撰寫論文、負責論文的修訂；王俊、孫永進行研究的實施與可行性分析；陳晴晴、俞俊嶺進行數(shù)據(jù)收集；王俊、俞俊嶺進行數(shù)據(jù)整理；張棟進行統(tǒng)計學處理；王俊、楊奕、喬亮進行結(jié)果的分析與解釋；孫永負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。