付漢斌 羅琳

湖北省武漢市武昌醫(yī)院口腔科，武漢 430063

唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic car-cinoma，SACC）作為唾液腺高發(fā)惡性腫瘤，具有較強(qiáng)的侵襲力，可沿神經(jīng)或血循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，特別是易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，患者總體預(yù)后不佳，死亡率較高。研究[1]表明，高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移特性是導(dǎo)致患者死亡的主要因素。目前，對(duì)SACC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制尚未完全清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為一類長(zhǎng)度在200個(gè)核苷酸以上的內(nèi)源性RNA，不具有編碼蛋白能力或僅能編碼小分子多肽，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其參與了多種腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，且與惡性腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)。

HOX反義基因間RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）作為重要的lncRNA類型，參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程，且有許多研究指出，HOTAIR在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)。本研究分析SACC組織中HOTAIR表達(dá)，探討其與患者臨床病理指標(biāo)以及預(yù)后的相關(guān)性，以期為SACC機(jī)制研究及預(yù)后判斷提供臨床資料。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2007年3月至2014年3月在武漢市武昌醫(yī)院口腔科行手術(shù)切除治療的SACC患者86例為研究對(duì)象，其中男性37例，女性49例，年齡23～74歲，平均年齡（53.04±12.23）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）術(shù)前未行放化療治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診；2）臨床資料完整且完成院外隨訪。腫瘤部位：小唾液腺39例，大唾液腺47例。病理學(xué)類型：實(shí)體型25例，管狀型29例，篩孔型32例。按照TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期48例；發(fā)生神經(jīng)侵犯43例，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例。手術(shù)過(guò)程中取SACC組織，置于凍存管中，-80 ℃保存。

同期選取因唾液腺良性腫瘤行手術(shù)治療患者45例作為對(duì)照，留取距離腫瘤邊緣>2 cm正常唾液腺組織，其中男性20例，女性25例，平均年齡（54.15±11.97）歲，與SACC患者在性別、年齡無(wú)差異（P>0.05）。本研究通過(guò)武漢市武昌醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)HOTAIR表達(dá)水平 取SACC組織和正常唾液腺組織，剪碎后研磨，按總RNA提取試劑盒（上海市閃晶分子生物科技有限公司）用Trizol法提取總RNA，使用分光光度計(jì)（日立公司，日本）檢測(cè)總RNA純度，OD260/OD280在1.80～2.20為純度高。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連市寶生物工程有限公司）對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）。按照PCR擴(kuò)增試劑盒（大連市寶生物工程有限公司）說(shuō)明用7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司，美國(guó)）對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：HOTAIR上游5’-GGGTGGCT-CACTCTTCTGGC-3’，下游5’-TGGCCTTGCCCGG-GCTTGTC-3’；β肌動(dòng)蛋白上游5’-GACCTCTATG-CC AACACAGT-3’，下游5’-AGTACTTGCGCTCA-GGAGGA-3’。PCR條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，74 ℃ 30 s，循環(huán)40次。使用2 ΔΔCt法計(jì)算SACC組織和正常唾液腺組織中的HOTAIR表達(dá)水平，2 ΔΔCt表示為SACC組織較正常唾液腺組織中基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)，ΔCt=Ct（目的）-Ct（內(nèi)參）；ΔΔCt=ΔCt（SACC組織） ΔCt（正常唾液腺組織）。

1.2.2 病例隨訪 SACC患者于術(shù)后隨訪，隨訪形式包括門診復(fù)查、電話、住院病歷查閱等，隨訪截止日期為2019年3月31日，以死亡作為終點(diǎn)事件，記錄患者死亡情況及生存時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SACC患者腫瘤組織和因唾液腺良性腫瘤行手術(shù)治療患者的正常唾液腺組織間HOTAIR表達(dá)量比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同病理學(xué)類型的SACC組織中HOTAIR表達(dá)量比較采用單因素方差分析；以SACC患者組織中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量的四分位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗(yàn)對(duì)兩組生存時(shí)間進(jìn)行比較；以年齡、性別、腫瘤部位、病理學(xué)類型、腫瘤直徑、TNM分期、神經(jīng)侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為自變量，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)影響預(yù)后的多因素進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR在SACC組織和正常唾液腺組織中表達(dá)水平比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，SACC組織中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量為2.48±0.22，高于正常唾液腺組織的1.03±0.13，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=39.812，P<0.001）。

2.2 HOTAIR在不同臨床病理指標(biāo)的SACC患者組織中表達(dá)水平比較

不同年齡、性別、部位、病理學(xué)類型和直徑的SACC組織中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、未發(fā)生神經(jīng)侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生神經(jīng)侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移SACC患者組織中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3 HOTAIR表達(dá)水平對(duì)SACC患者生存時(shí)間的影響

截止2019年3月31日，86例患者中46例患者死亡，隨訪時(shí)間9～144個(gè)月，中位隨訪時(shí)間51.5個(gè)月。以SACC患者組織中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量的四分位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，分為低表達(dá)組（n=22）和高表達(dá)組（n=64例）。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，低表達(dá)組患者平均生存時(shí)間（113.32±10.77）個(gè)月，累積生存率72.73%，高表達(dá)組患者平均生存時(shí)間（59.75±6.50）個(gè)月，累積生存率39.06%；Log-Rank檢驗(yàn)示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.242，P=0.004），見(jiàn)圖1。

2.4 影響SACC患者預(yù)后的多因素分析

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HOTAIR高表達(dá)是影響SACC患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（HR=3.274、2.971、2.911，P<0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

SACC作為中老年人群的高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)生及進(jìn)展機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全清楚。隨著臨床上根治性手術(shù)切除聯(lián)合放化療的應(yīng)用，SACC患者生存率得到提高，但由于腫瘤侵襲力強(qiáng)，且具有嗜神經(jīng)生長(zhǎng)的特性，治療后易發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響了患者生存質(zhì)量及生存時(shí)間。因此，深入探討SACC發(fā)生進(jìn)展機(jī)制以及與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的敏感基因或生物標(biāo)志物，對(duì)患者早期診療及改善預(yù)后具有重要意義。

表 1 不同臨床病理指標(biāo)SACC組織中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量的比較Tab 1 Comparison on the relative expression levels of HOTAIR in SACC tissues with different clinico pathological indexes

圖 1 HOTAIR表達(dá)水平對(duì)SACC患者生存時(shí)間的影響的Kaplan-Meier分析圖Fig 1 Kaplan-Meier analysis chart of the effect of HOTAIR expres -sion level on survival time of SACC patients

表 2 影響SACC患者預(yù)后的多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析Tab 2 Analysis on multiple factors influencing the prognosis of patients with SACC by using Cox proportional hazards regression

lncRNA作為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，其在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及惡性生物學(xué)特性中的作用越來(lái)越受到重視，有研究[2-3]指出，頭頸部惡性腫瘤組織中出現(xiàn)多種lncRNA表達(dá)異常。lncRNA異常表達(dá)與頸部惡性腫瘤細(xì)胞惡性增殖、遷移及侵襲密切相關(guān)。

HOTAIR作為一種lncRNA，下調(diào)其表達(dá)可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其表達(dá)則可促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制凋亡，從而促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤對(duì)地塞米松的化學(xué)耐藥性。亦有研究[4]指出，HOTAIR可促進(jìn)鼻咽癌的侵襲和遷移。本研究結(jié)果顯示，SACC組織中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量高于正常唾液腺組織，說(shuō)明HOTAIR在SACC組織中呈高表達(dá)，可能參與了SACC發(fā)生過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生神經(jīng)侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移SACC患者組織中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量升高，說(shuō)明HOTAIR高表達(dá)可能參與了SACC惡性進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程。這些結(jié)果提示HOTAIR可能通過(guò)影響SACC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力而參與了SACC發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程。

有研究指出，HOTAIR可作為腫瘤疾病患者的預(yù)后循環(huán)標(biāo)志物。Da等[5]指出，HOTAIR的高表達(dá)水平與胃癌患者較差的生存期有關(guān)，可能是胃癌潛在獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，低表達(dá)組患者平均生存時(shí)間和累積生存率均高于高表達(dá)組，說(shuō)明HOTAIR表達(dá)與SACC患者生存時(shí)間和生存率有關(guān)， HOTAIR低表達(dá)患者有更長(zhǎng)的生存時(shí)間和更高的生存率。本研究Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，HOTAIR表達(dá)是影響SACC患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，進(jìn)一步說(shuō)明HOTAIR表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)，是影響患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素，提示HOTAIR可能是SACC潛在的預(yù)后生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，HOTAIR在SACC患者組織中呈高表達(dá)，與腫瘤惡性化進(jìn)展及患者不良預(yù)后有關(guān)，有望成為SACC患者預(yù)后評(píng)估的潛在標(biāo)志物。但鑒于本研究樣本量有限，且是單中心研究，尚需進(jìn)一步開展多中心、大樣本的隊(duì)列研究予以確證。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。