翁旭 李勁松 范松

1.汕頭市中心醫(yī)院口腔科，汕頭 515031；2.中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院口腔科，廣州 510120

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcino-ma，OSCC）是口腔癌的一種高發(fā)類型，發(fā)病率約占口腔癌的85%[1]，具有發(fā)病迅速、轉(zhuǎn)移率高等特點[2]，但發(fā)病機制目前尚未完全明確。癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜過程，也是導(dǎo)致治療失敗和死亡的主要原因之一，因此尋找新的治療靶點尤為迫切。長鏈非編碼RNA（long-chain noncoding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白的RNA分子，長度介于200～100 000 nt[3]。研究[4]表明，lncRNA在腫瘤細胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移及化療耐藥等相關(guān)的信號通路方面均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其作用類似于癌基因或抑癌基因。lncRNA PCGEM1是一種在前列腺癌細胞中特異性高表達的lncRNA，可促進前列腺癌細胞的增殖和遷移[5]。目前關(guān)于lncRNA PCGEM1在OSCC中的作用研究報道甚少，本研究探討lncRNA PCGEM1對OSCC細胞增殖侵襲及遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 組織標本

收集2016年6月—2018年3月于汕頭市中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的80例OSCC患者的癌組織及距離癌組織超過2 cm處的正常組織，用以上組織構(gòu)建組織芯片免疫組織化學(xué)染色，80例患者的組織標本中有20例出現(xiàn)了不同程度缺失，剩余60例經(jīng)組織病理學(xué)檢測證實為原發(fā)性O(shè)SCC，納入本研究。60例患者年齡36～75歲，中位年齡53歲。所有患者均同意本研究并簽署知情同意書，且經(jīng)汕頭市中心醫(yī)院倫理委員會審核批準后收集標本。

1.2 細胞及主要試劑和儀器

人正?？谇火つど掀ぜ毎╫ral mucosa epithelial cell，OMEC）及人源OSCC細胞株KB、BcaCD885、SCC-4、CAL27、SCC-15均購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）。

DMEM培養(yǎng)基、SYBR Green Ⅰ實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測試劑盒（TOYOBO公司，日本），Trizol 試劑盒（TaKaRa公司，日本），Trans-well小室（BD公司，美國），MTT試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Airtech超凈工作臺（江蘇蘇凈集團有限公司），MCO-15AC細胞培養(yǎng)箱（SANYO公司，日本），Ti-U/Ti-S倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本），5810R型高速離心機（Ep-pendorf公司，美國），R480 qRT-PCR儀（Roche公司，瑞士）。siPCGEM1及陰性對照（negative con-trol，NC，相對于siPCGEM1的siRNA隨機序列）片段、PCGEM1、miR-148a及U6引物均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計完成。

1.3 qRT-PCR檢測lncRNA PCGEM1的表達

依據(jù)TRIzol法提取癌組織、正常組織及OMEC、KB、BcaCD885、SCC-4、CAL27、SCC-15細胞株樣本的總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄，按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，所有操作嚴格按照試劑盒要求執(zhí)行。采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置qRT-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：1）預(yù)變性，75 ℃，120 s；2）變性，90 ℃，5 min；3）退火，60 ℃，60 s；4）延伸，72℃，30 s；5）qRT-PCR儀采集熒光信號40個循環(huán)。U6作為內(nèi)參，上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；lncRNA PCGEM1的上游引物為5’-GCGGCGGTTAATGCTA-ATTGTG-3’ ，下游引物為5’-ATCCAGTGCAGGG-TCCGAGG-3’；miR-148a的上游引物為5’-ATGCA-GTCTCCACAGCAGCAGAG-3’，下游引物為5’-CG-AACGGAATGTGCGGAAGTG-3’。相對表達量用2 ΔΔCT表示。每個樣本獨立重復(fù)實驗3次。

1.4 分析lncRNA PCGEM1和miR-148a的表達與患者臨床病理特征間的關(guān)系

以lncRNA PCGEM1和miR-148a在OSCC組織中相對表達量中位數(shù)作為節(jié)點，將患者分為lncRNA PCGEM1高表達組、lncRNA PCGEM1低表達組及miR-148a高表達組、miR-148a低表達組，分析不同表達組間患者臨床病理特征（性別、年齡、TNM分期、組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑）的差異。

1.5 細胞系構(gòu)建

調(diào)整KB細胞株密度至1×106個·mL-1，取2 mL接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，采用Lipofectamine 2000將濃度均為100 nmol·L-1的siPCGEM1和陰性對照轉(zhuǎn)染至細胞，將細胞分為KB-siPCGEM1組及KB-NC組，并以未處理的KB細胞作為空白對照組。

1.6 MTT實驗檢測細胞增殖

將KB、KB-NC及KB-siPCGEM1按照每孔1×103個細胞密度鋪至96孔板，設(shè)24、48、72、96 h 4個時間點，每個時間點設(shè)5個復(fù)孔，輕輕混勻后，置入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。于設(shè)定時間點取出96孔板，每孔加MTT溶液20 μL，37 ℃避光4 h后棄掉孔內(nèi)液體，再加二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）各100 μL，置于37 ℃搖床上快速振蕩15 min，以充分溶解結(jié)晶物，最后將96孔板置于酶標儀上檢測492 nm處的OD值。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲

實驗前12 h更換為無血清培養(yǎng)基，將40 μL基質(zhì)膠（matrigel）鋪于Transwell小室（規(guī)格24孔，孔徑8 μm）中，消化細胞并用1×PBS清洗2遍，將500 μL完全培養(yǎng)基加入24孔板，細胞計數(shù)，取5×105個細胞重懸，向Transwell小室中加200～250 μL細胞懸液，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無氣泡。置于培養(yǎng)箱內(nèi)正常培養(yǎng)24 h，加用甲醇配制、PBS稀釋的0.1%結(jié)晶紫染液500 μL進行染色，室溫避光15 min，PBS漂洗以后用棉棒擦Transwell小室內(nèi)部，倒置晾干，置于倒置顯微鏡下觀察穿過膜的細胞并拍照計數(shù)。

1.8 劃痕實驗檢測細胞遷移

將KB、KB-NC及KB-siPCGEM1按5×105個/孔均勻鋪至6孔板，用10 μL白槍頭劃線并以尺子輔助，加PBS將細胞碎片沖洗掉，然后加1%血清的培養(yǎng)基，置于顯微鏡下拍照并做好標記，此時記為0 h，繼續(xù)于37 ℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)，24 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞運動情況并拍照。

1.9 生物信息學(xué)預(yù)測

用生物信息學(xué)網(wǎng)站starBase預(yù)測lncRNA PCGEM1可互補結(jié)合的微小RNA（microRNA，miRNA），再根據(jù)www.microRNA.org網(wǎng)站預(yù)測相應(yīng)miRNA可靶向結(jié)合的基因。

1.10 雙熒光素酶報告基因檢測

通過miRBase數(shù)據(jù)庫獲得人的PCGEM1和轉(zhuǎn)化生長因子β2（transforming growth factor β2，TGF β2）基因序列，以HNEC細胞基因組DNA為模板，采用qRT-PCR擴增PCGEM1和TGFβ2的3’-非翻譯區(qū)序列，構(gòu)建至熒光素酶報告基因載體psi-CHECK中，記為野生型lncRNA PCGEM1-wild和TGF β2 wild，同時構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒lncRNA PCGEM1-mutant和TGF β2 mutant。將HEK293T細胞按30%左右密度鋪于24孔板，將miRNA-148a模擬物（miRNA-148a mimic）以及miRNA-148a模擬物的對照物（mimic control）分別與野生型lncRNA PCGEM1-wild及突變型重組質(zhì)粒lncRNA PCGEM1-mutant、TGF β2 mutant共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞，以空載質(zhì)粒作為對照。轉(zhuǎn)染后24 h，根據(jù)雙熒光素酶測定試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.11 免疫印跡（Western blotting）檢測

將轉(zhuǎn)染48 h的KB細胞，加入適量的RIPA裂解液裂解30 min，12 000 r·min-14 ℃離心10 min，收集上清，用總蛋白提取試劑盒分別提取組織及細胞中總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量。制備蛋白樣品并進行十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sul-fate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加含有5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的封閉液室溫下封閉2 h。分別加適量用封閉液稀釋的TGF β2、p-Smad2一抗，之后置于4 ℃冰箱過夜。次日用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBST）將膜沖洗干凈，再分別加稀釋好的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，PBST洗膜，增強化學(xué)發(fā)光法（polymerase chain reaction-enhanced chemilu-minecence，ECL）對結(jié)合的抗體進行觀察，暗室曝光拍照，同時以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用百分比表示，組間對比采用卡方檢驗，計量資料以平均值±標準差表示，采用t檢驗進行分析。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA PCGEM1、miR-148a在不同組織及細胞中的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示，1）OSCC組織中miR-148a、lncRNA PCGEM1的表達水平高于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；2）與OMEC相比，lncRNA PCGEM1、miR-148a在KB、BcaCD885、SCC-4、CAL27、SCC-15中的表達明顯升高（P<0.05），其中KB的lncRNA PCGEM1和miR-148a表達最高，與其他OSCC細胞相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。

2.2 lncRNA PCGEM1和miR-148a在OSCC不同臨床病理中表達的差異

60例患者lncRNA PCGEM1的相對表達量在0.56～1.43范圍內(nèi)，以中位數(shù)0.96為分組界值，<0.96記為lncRNA PCGEM1低表達（22例），≥0.96記為lncRNA PCGEM1高表達（38例）；miR-148a的相對表達量在0.52～1.22范圍內(nèi)，以中位數(shù)為0.86為分組界值，<0.86記為miR-148a低表達（32例），≥0.86記為lncRNA PCGEM1高表達（28例）。統(tǒng)計分析表明，lncRNA PCGEM1和miR148a低表達者的性別、年齡和腫瘤直徑的比例與高表達者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織分化程度的比例與高表達者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

圖 1 lncRNA PCGEM1、miR-148a在不同組織及細胞中的表達Fig 1 Expression of lncRNA PCGEM1 and miR-148a in different tissues and different cell lines

2.3 細胞系構(gòu)建

qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組和KB-NC組相比，KB-siPCGEM1組中l(wèi)ncRNA PCGEM1的表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；空白對照組和KB-NC組中l(wèi)ncRNA PCGEM1的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），提示成功構(gòu)建lncRNA PCGEM1沉默細胞系（圖2）。

2.4 lncRNA PCGEM1對OSCC細胞株KB增殖能力的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，與空白對照組和KB-NC組相比，KB-siPCGEM1組OD492nm值明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明lncRNA PCGEM1被沉默后，細胞增殖能力顯著降低（圖3）。

表 1 lncRNA PCGEM1和miR-148a在OSCC不同臨床病理中表達的差異Tab 1 Differences in expression of lncRNA PCGEM1 and miR-148a in different clinicopathologic OSCC

圖 2 lncRNA PCGEM1在各組KB中的表達Fig 2 Expression of lncRNA PCGEM1 in KB of each group

2.5 lncRNA PCGEM1對OSCC細胞株KB侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，空白對照組、KB-NC組和KB-siPCGEM1組的侵襲細胞數(shù)分別為（412±53）、（396±48）、（182±25）個。與空白對照組和KB-NC組相比，KB-siPCGEM1組細胞侵襲數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。該結(jié)果表明沉默lncRNA ANCR后，細胞侵襲能力明顯降低（圖4）。

圖 3 lncRNA PCGEM1對OSCC細胞株KB增殖能力的影響Fig 3 Effect of lncRNA PCGEM1 on KB proliferation of OSCC cell line

2.6 lncRNA PCGEM1對OSCC細胞株KB遷移能力的影響

劃痕實驗的結(jié)果顯示，空白對照組、KB-NC組和KB-siPCGEM1組的細胞遷移率分別為78.21%±3.43%、80.23%±3.09%、43.64%±2.51%。與空白對照組和KB-NC組相比，KB-siPCGEM1組細胞遷移率下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明沉默lncRNA PCGEM1后，細胞遷移能力下降（圖5）。

圖 5 lncRNA PCGEM1對OSCC細胞株KB遷移能力的影響 倒置顯微鏡 × 200Fig 5 Effect of lncRNA PCGEM1 on KB migration of OSCC cell line inverted microscope × 200

2.7 生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報告基因檢測

starBase網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示，lncRNA PCGEM1可與miR-148a互補結(jié)合，再經(jīng)www.microRNA.org網(wǎng)站預(yù)測分析顯示，miR-148a與TGF β2存在靶向結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-148a mimic后，lnc RNA PCGEM1-wild和TGFβ2 wild的熒光素酶活性被抑制（P<0.05），而lnc RNA PCGEM1-mutant和TGFβ2 mutant的熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05），說明miR-148a與lncRNA PCGEM1和TGF β2具有靶向調(diào)控關(guān)系（圖6）。

2.8 lncRNA PCGEM1與TGF β2/Smad2的關(guān)系

qRT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，KB-siPCGEM1組中miR148a、TGF β2及p-Smad2的表達均低于空白對照組和KB-NC組（P<0.05），空白對照組和KB-NC組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖7）。

圖 6 雙熒光素酶報告基因檢測Fig 6 Double luciferase reporter gene detection

3 討論

OSCC是口腔惡性腫瘤中最為常見的類型，研究[6]表明，有多個癌基因及抑癌基因參與了OSCC的發(fā)生發(fā)展，從分子生物學(xué)角度出發(fā)尋找其進展和轉(zhuǎn)移的標志物，對于臨床上治療方法的選擇和患者預(yù)后的判斷有著重要的意義。

圖 7 lncRNA PCGEM1與TGF β2/Smad2的關(guān)系Fig 7 Relationship between lncRNA PCGEM1 and TGF β2/Smad2

目前關(guān)于lncRNA在腫瘤中的作用僅有一小部分被透徹研究，有些lncRNA在腫瘤中的表達異常，功能類似于癌基因或抑癌基因，可以通過參與調(diào)控細胞周期影響癌癥的發(fā)生發(fā)展[7]。目前，尚無標志性lncRNA可直接預(yù)測OSCC，但lncRNA PCGEM1在前列腺癌中特異性表達已被證實，該基因位于染色體2q32位點上[8]。Zhang等[9]采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)lncRNA PCGEM1在胃癌組織中的表達高于癌旁組織。Chen等[10]研究表明，在胰腺癌患者癌組織、血清及胰腺癌細胞分化過程中，lncRNA PCGEM1的表達量異常升高，而被沉默后，胰腺癌細胞的增殖能力減弱，并且增殖相關(guān)的基因表達量下降[11]，由此推測lncRNA PCGEM1對胰腺癌細胞的增殖起到促進作用。本研究采用qRT-PCR檢測lncRNA PCGEM1在OSCC組織和癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)其在OSCC組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，分析lncRNA PCGEM1表達與OSCC患者的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，lncRNA PCGEM1的表達在不同TNM分期、組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上存在明顯差異（P<0.05）。此外，本研究構(gòu)建了lncRNA PCGEM1沉默細胞系，探討lncRNA PCGEM1在OSCC中的作用，結(jié)果顯示lncRNA PCGEM1下調(diào)后，OSCC癌細胞KB的增殖、侵襲和遷移能力明顯下降，說明lncRNA PCGEM1在OSCC的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。

研究[12]表明，miRNA是通過堿基不完全互補的方式與靶基因結(jié)合，從而影響腫瘤細胞的凋亡、侵襲及遷移，并引發(fā)周圍細胞的壞死與凋亡。同時，miRNA也是lncRNA發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)。本研究通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA PCGEM1可與miR-148a互補結(jié)合。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a在食管癌組織中的表達低于正常癌旁組織，上調(diào)miR-148a表達可促進食管癌細胞的增殖和遷移，miR-148a作為癌基因?qū)κ彻馨┑倪M展具有促進作用。本研究結(jié)果顯示，miR-148a的表達在不同TNM分期、組織分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上存在明顯差異（P<0.05）。本研究中，OSCC組織miR-148a的表達明顯高于正常組織，KB細胞lncRNA PCGEM1沉默后，miR-148a表達下調(diào)。提示lncRNA PCGEM1促進OSCC細胞株KB的增殖作用可能與上調(diào)miR-148a有關(guān)。研究[14]表明，TGF β2也是miR-148a下游的作用靶點之一，miR-148a可與TGF β2的3’非翻譯區(qū)（3’ untranslated regions，3’UTR）互補結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，調(diào)控TGF β2下游信號通路。www.microRNA.org網(wǎng)站預(yù)測分析顯示，miR-148a可互補結(jié)合TGF β2。本研究通過熒光素酶基因報告分析也證實二者存在調(diào)控關(guān)系。TGF β2/Smad2信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，該通路通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Smad蛋白實現(xiàn)細胞內(nèi)通路信號的傳導(dǎo)[15]。Smad蛋白包括Smad1～Smad9，其中當(dāng)Smad2磷酸化水平受到抑制時，TGF β2/Smad2信號通路的生物學(xué)功能發(fā)生轉(zhuǎn)變，對腫瘤細胞增殖和侵襲起到抑制作用[16]。Yu等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，下調(diào)lncRNA PCGEM1表達后，TGF β2蛋白表達水平降低，結(jié)直腸癌的侵襲及遷移受到抑制。本研究中，KB-siPCGEM1組miR-148a表達下調(diào)后，TGF β2、p-Smad2蛋白的表達量降低。因此推斷，lncRNA PCGEM1可能通過調(diào)節(jié)TGF β2/smad2信號通路影響癌癥的進展。

綜上，lncRNA PCGEM1在OSCC中高表達，高表達lncRNA PCGEM1可能通過上調(diào)miR-148a水平，強化TGF β2/Smad2信號通路，從而促進OSCC的進展。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。