陳越 魏翔 蔣丁勝 劉立剛

430030 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心臟大血管外科

主動(dòng)脈夾層是一種心胸外科的常見急癥，因其發(fā)病急、進(jìn)展快、死亡率高，嚴(yán)重危害人類健康。最新統(tǒng)計(jì)顯示，主動(dòng)脈夾層發(fā)生率為6人/10萬(wàn)人/年，全因致死率為2.78/10萬(wàn)人[1]。特別是對(duì)于Stanford A型主動(dòng)脈夾層，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高[2]，患者及家屬常需承受巨大的精神和經(jīng)濟(jì)壓力。主動(dòng)脈夾層發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)病理生理學(xué)過程，包括平滑肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，但其具體分子機(jī)制尚未完全闡明。DJ-1基因，編碼PARK7蛋白，是一種廣泛存在于全身的絲裂原依賴性癌蛋白，在進(jìn)化中高度保守，屬于DJ-1/ThiJ/PfpI蛋白超家族[3]。目前，諸多研究證實(shí)DJ-1在神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是帕金森病[4]中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能，但心血管領(lǐng)域知之甚少。因此，本文對(duì)DJ-1在主動(dòng)脈夾層中的表達(dá)及作用進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 一般資料

主動(dòng)脈夾層主動(dòng)脈壁取自13例Stanford A型主動(dòng)脈夾層患者進(jìn)行血管置換手術(shù)來源標(biāo)本，所有患者均完成CT血管造影(CTA)并在此基礎(chǔ)上完成三維重建，分別于升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓、胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈處測(cè)量并記錄主動(dòng)脈直徑。正常主動(dòng)脈壁標(biāo)本從11例擴(kuò)張型心肌病或冠心病患者進(jìn)行心臟移植時(shí)獲得。標(biāo)本切除后部分速凍于液氮并保存于-80℃冰箱，部分保存于4%多聚甲醛溶液后經(jīng)石蠟包埋保存。以上所有手術(shù)均在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院完成，所有患者均已告知其標(biāo)本用途并簽署知情同意書。本研究經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 蘇木精-伊紅(HE)染色

蠟塊切片后先于65℃烤片1 h，后依次經(jīng)二甲苯、100%、95%和70%乙醇水合，再經(jīng)蘇木精(5 min)、1%鹽酸乙醇(1 s)、Scott液(1 min)和伊紅(1 min)染色，最后經(jīng)70%、95%、100%乙醇和二甲苯脫水封片，顯微鏡(Olympus公司，日本)下觀察并比較主動(dòng)脈夾層與正常主動(dòng)脈壁標(biāo)本的基本病理改變。

1.3 彈性纖維(EVG)染色

蠟塊切片烤片并經(jīng)水合后，依次經(jīng)高錳酸鉀(5 min)、草酸(5 min)、95%乙醇(5 s)后，在Elastin染液中過夜孵育后再次95%乙醇(5 s)分化鏡檢，流水沖洗后經(jīng)Van Gieson染液(1 min)、95%乙醇(5 s)，最后脫水封片，鏡下觀察主動(dòng)脈壁中彈性纖維(紅色區(qū)域)斷裂情況及中膜的完整性，分析中層破壞程度。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)

取主動(dòng)脈夾層和正常主動(dòng)脈壁組織，利用TRIzol試劑(Invitrogen)，通過酚氯仿抽提法提取組織中的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme)逆轉(zhuǎn)為cDNA。以18S為內(nèi)參，采用RT-PCR儀器(Bio-Rad公司，美國(guó))分別擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，根據(jù)Ct值計(jì)算各組織中相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行比較分析。PCR反應(yīng)體系為10 μl，采用兩步法，95℃ 5 min后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95℃ 5 s和60℃ 30 s。DJ-1引物序列：正向5’-GCTCTGTTGGCTCATGAAATAG-3’，反向5’- CAGAGTAGGTGTAATGACCTCC-3’；18S引物序列：正向5’- CTCAACACGGGAAACCTCAC-3’，反向5’- CGCTCCACCAACTAAGAACG-3’。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

主動(dòng)脈夾層患者與無(wú)主動(dòng)脈夾層患者的臨床基本資料如表1所示，兩組各項(xiàng)資料比較均無(wú)顯著差異(均為P>0.05)。CTA三維重建顯示，主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈經(jīng)內(nèi)膜破口撕裂，出現(xiàn)巨大假腔，導(dǎo)致各重要器官供血不足(圖1)。HE染色顯示，正常主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)完整，平滑肌細(xì)胞排列有序(圖2)；而主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈壁中平滑肌細(xì)胞部分出現(xiàn)凋亡，排列混亂，同時(shí)可見淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，提示局部炎癥反應(yīng)較重(圖2)。此外，EVG染色可見，正常主動(dòng)脈中層具有排列緊密的彈性纖維，未見斷裂；相比于正常組織，夾層的主動(dòng)脈壁中膜彈性纖維顯著減少，排列紊亂，且大量彈性纖維斷裂導(dǎo)致間隙變大(圖2)，這與主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈壁張力和彈性減弱的臨床表現(xiàn)一致。

表1 主動(dòng)脈夾層組與無(wú)主動(dòng)脈夾層組患者的臨床資料比較

FL：假腔；TL：真腔。A：主動(dòng)脈弓：在主動(dòng)脈弓平面可見夾層所造成的主動(dòng)脈假腔巨大且壓迫真腔，影響血液供應(yīng)；B：升主動(dòng)脈和胸主動(dòng)脈：主動(dòng)脈夾層的假腔起源于升主動(dòng)脈，沿主動(dòng)脈弓一直撕裂主動(dòng)脈壁至胸主動(dòng)脈；C：三維重建正位：可見主動(dòng)脈夾層破口起源于升主動(dòng)脈，經(jīng)主動(dòng)脈弓延伸至胸主動(dòng)脈；D：三維重建背位：從背側(cè)可見主動(dòng)脈夾層的假腔包裹真腔，導(dǎo)致血管受壓，血供不足

HE染色顯示，主動(dòng)脈夾層患者的血管壁較正常主動(dòng)脈壁細(xì)胞排列紊亂，部分平滑肌細(xì)胞凋亡；EVG染色顯示，正常的血管壁彈性纖維排列緊密，而主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈壁彈性纖維降解斷裂，排列無(wú)序

RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DJ-1 mRNA水平在主動(dòng)脈夾層樣本中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖3)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.000±0.788 比 0.314±0.381，t=2.64，P=0.02)。由此可見，主動(dòng)脈夾層中，DJ-1在轉(zhuǎn)錄過程中呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，最終可能導(dǎo)致蛋白水平的降低，推測(cè)其表達(dá)水平的降低促進(jìn)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步將DJ-1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平與主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈各部位直徑作相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)DJ-1的表達(dá)與患者的升主動(dòng)脈、主動(dòng)脈弓、胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈直徑均無(wú)顯著相關(guān)性(r2=0.014，P=0.71；r2=0.002，P=0.90；r2=0.001，P=0.95和r2=0.000，P=0.97)。綜上所述，DJ-1可能參與主動(dòng)脈夾層的病理生理過程。

圖3 DJ-1 mRNA在主動(dòng)脈夾層(n=13)和正常主動(dòng)脈壁(n=11)中的表達(dá)

3 討論

主動(dòng)脈夾層的形成是一個(gè)多重機(jī)制參與的過程[5]，如炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)降解和平滑肌細(xì)胞凋亡等。其中，氧化應(yīng)激可致主動(dòng)脈壁中層退化，導(dǎo)致管腔變薄，在主動(dòng)脈夾層的形成中具有重要作用。研究表明，在主動(dòng)脈夾層患者樣本中，超氧化物歧化酶的表達(dá)較正常組低50%，而脂質(zhì)過氧化物卻顯著升高[6]，提示氧化應(yīng)激的增強(qiáng)是夾層發(fā)生的重要誘因。缺氧所導(dǎo)致的缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1α)和E26轉(zhuǎn)錄因子-1(E26 transformation specific-1，Ets-1)上調(diào)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9表達(dá)增加，最終加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及動(dòng)脈瘤的形成[7]。由此可見，氧化應(yīng)激相關(guān)調(diào)控蛋白在夾層的病理生理過程中具有重要作用。隨著研究深入，DJ-1在多種組織和器官的功能逐漸被闡明，均提示該分子在氧化應(yīng)激中發(fā)揮調(diào)控作用。在小鼠Neuroa神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，DJ-1下調(diào)可增強(qiáng)由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]，提示其保護(hù)作用。在機(jī)制上，DJ-1通過調(diào)節(jié)硫氧還蛋白/凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(thioredoxin/ASK1)復(fù)合體抑制過氧化氫所致的氧化應(yīng)激。此外，DJ-1可抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激中的關(guān)鍵分子核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 like 2，Nrf2)的泛素化和降解，并通過促進(jìn)入核，增強(qiáng)其與硫氧還蛋白1(thioredoxin-1，Trx1)啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件ARE的結(jié)合，發(fā)揮其抗氧化功能[9]。本研究顯示，DJ-1在主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈壁中的mRNA表達(dá)水平顯著低于正常組，提示DJ-1的下調(diào)可能減弱了機(jī)體的抗氧化應(yīng)激能力，進(jìn)而導(dǎo)致彈性纖維的斷裂，最終發(fā)生主動(dòng)脈夾層。

血管平滑肌細(xì)胞作為主動(dòng)脈中層的重要組成成分，在維持血管張力和彈性中具有關(guān)鍵作用。血管平滑肌細(xì)胞的增殖減少和凋亡增加也是主動(dòng)脈夾層的重要發(fā)病因素。研究顯示，Cu(Ⅱ)ATSM(一種缺氧敏感的正電子發(fā)射斷層顯像劑)通過激活Nrf2/DJ-1信號(hào)通路介導(dǎo)其在冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中的保護(hù)作用[10]。此研究證實(shí)DJ-1在平滑肌細(xì)胞上的抗氧化應(yīng)激作用，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，進(jìn)一步提示該分子有可能對(duì)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用。不過，DJ-1的表達(dá)量與主動(dòng)脈直徑無(wú)顯著相關(guān)性，提示其可能不參與主動(dòng)脈的病理變化過程，但與夾層的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過探究DJ-1在主動(dòng)脈夾層患者主動(dòng)脈壁中的表達(dá)，提示其在主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用，為進(jìn)一步闡明主動(dòng)脈夾層的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。但對(duì)于DJ-1的調(diào)控機(jī)制，是否通過抗氧化應(yīng)激功能發(fā)揮其保護(hù)功能，還有待進(jìn)一步探討。隨著研究深入，DJ-1可能成為預(yù)防和治療主動(dòng)脈夾層的有效干預(yù)靶點(diǎn)。

利益沖突：無(wú)