侯江厚 姚穎杰 詹曉燕 楊奕梅

650031 昆明市婦幼保健院產(chǎn)科

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性多因素導致的炎癥性疾病，在世界范圍內(nèi)具有很高的發(fā)病率和致死率，其病理過程起始于血管內(nèi)皮損傷，繼而引起淋巴細胞浸潤、血管平滑肌細胞增殖和泡沫細胞形成，最終導致動脈粥樣斑塊形成[1]。AS的危險因素包括高血壓、高血脂、糖尿病、吸煙、高同型半胱氨酸和感染等，在各獨立危險因素中脂代謝異常是首要因素，尤其是氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)是AS的主要危險因子[2]。ox-LDL可以從多方面、多途徑損傷血管內(nèi)皮細胞，誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡，影響內(nèi)皮細胞通透性、分泌調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)并導致內(nèi)皮細胞功能障礙[3-4]。

研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)在AS的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[5-7]，其中l(wèi)et-7在血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中大量存在，能夠通過調(diào)控目標靶基因的表達引起血管內(nèi)皮細胞凋亡和平滑肌細胞增殖、遷移[8-9]。同時，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)參與了AS發(fā)生過程中多種相關(guān)基因表達的調(diào)控[10-11]。NF-κB信號轉(zhuǎn)導途徑活化是ox-LDL作用于內(nèi)皮細胞促使細胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-l)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)等炎癥細胞因子和細胞粘附分子表達的重要調(diào)控通路，是參與AS發(fā)病過程的重要分子機制之一[12]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α誘導蛋白3(TNF-α induced protein 3，TNFAIP3)，亦稱鋅指蛋白A20，能夠通過其雙重的泛素化酶活性，作用于IKK復合體信號通路上游的關(guān)鍵分子，如RIP1、TRAF6等，阻止IKK被磷酸化，抑制NF-κB的進一步活化，發(fā)揮反饋性調(diào)節(jié)作用，抑制炎癥反應(yīng)[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，let-7f通過靶向抑制A20表達，活化NF-κB信號通路，釋放TNF、IL-1b等細胞因子，在結(jié)核桿菌感染巨噬細胞的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[14]。因此，我們推測，ox-LDL可能通過上調(diào)let-7f抑制其靶基因A20的表達，使IKK被磷酸化，并導致NF-κB通路活化，從而引起血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)。本研究擬選取let-7家族的重要成員let-7f作為研究對象，通過建立ox-LDL誘導血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)模型，觀察let-7f在ox-LDL所致血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)過程中的變化規(guī)律，探討let-7f調(diào)控血管內(nèi)皮細胞炎癥因子表達的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)、HEK293細胞購自美國Science Cell公司；胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國GIBCO公司；ox-LDL購自協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學研究所(MDA含量：22 nmol/L，4℃避光保存，2周適用)；人ICAM-1 ELISA檢測試劑盒購自美國RapidBio Lab公司；細胞核蛋白提取試劑盒購自上海碧云天公司；A20抗體、p-IKK抗體、NF-κB抗體、p-NF-κB抗體購自美國Santa Cruz公司，Lamin B1抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德公司；96孔酶標板購自美國Costar公司；總RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司，miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、點突變試劑盒、Dual LuciferaseReporter Assay System試劑盒購自美國Invitrogen公司，let-7f mimics、let-7f PCR 引物、U6引物、miRNA SYRB Green實時熒光定量試劑盒均購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 凍存HUVEC復蘇后，用含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 g/L鏈霉素的DMEM接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長融合成致密單層，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化，以1∶3傳代，輕輕吹散后將細胞均勻接種于培養(yǎng)皿中，待細胞融合至50%，用Lipofectamine 2000試劑將let-7f mimics、miR-NC瞬時轉(zhuǎn)染至HUVEC，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 分組 實驗分為正常對照組(未添加ox-LDL)、10 μg/ml ox-LDL組、20 μg/ml ox-LDL組、50 μg/ml ox-LDL組、100 μg/ml ox-LDL組和200 μg/ml ox-LDL組共 6組，細胞置于37℃、5%CO2、95%空氣、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后待用。

1.2.3 RNA的提取和實時熒光定量PCR 按試劑盒說明書提取各組HUVEC的總RNA，提取出的總RNA通過TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA，let-7f的表達水平采用TaqMan miRNA實時熒光定量PCR試劑盒檢測，let-7f cDNA擴增引物購自Applied Biosystems，PCR條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)。Let-7f的相對表達量以U6作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計算，每個樣品重復3次。

1.2.4 雙抗體夾心ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液ICAM-1含量 按試劑盒說明書進行測定。標準品用標本稀釋液按一定比例稀釋成系列標準液，將其與HUVEC培養(yǎng)液樣品分別加入96孔酶標板內(nèi)，并留出空白孔，封好后于37℃孵箱孵育90 min；經(jīng)5次洗板，向空白孔外的其他反應(yīng)孔加生物素化抗體工作液100 μl/孔，封板后37℃孵育60 min；再5次洗板，各孔與酶結(jié)合物工作液100 μl/孔37℃孵育30 min；洗板后加入顯色劑A、B各50 μl/孔，37℃避光孵育15～25 min；最后加入終止液100 μl/孔，混勻后于5 min內(nèi)測定OD450。標準品及樣品的OD值系減去空白孔OD所得。

1.2.5 細胞核蛋白的制備 依據(jù)核蛋白提取試劑盒說明進行，將各組培養(yǎng)皿中的HUVEC用0.25%胰蛋白酶消化5 min，終止消化并吹打下來后，用冷PBS(1 mmol/L Na3VO4，5 mmol/L NaF)洗滌細胞2次；移入離心管管中，4℃離心300 g×5 min，棄上清；加入5 ml GENMED清理液，用移液管混勻細胞顆粒群，4℃離心300 g×5 min，棄上清；加入500 μl預冷的GENMED胞解液，混勻，移出細胞液到預冷的無菌Eppendorf管中，強力渦旋震蕩15 s，放進冰槽里孵育15 min，其間強力渦旋震蕩15 s一次；即刻4℃離心16 000 g×5 min，留取上清液制備胞漿總蛋白。沉淀加入500 μl預冷的GENMED清理液，4℃離心300 g×5 min，棄上清，重復兩次；沉淀加入200 μl含有GENMED裂解液和GENMED活性液的GENMED裂解工作液，強力渦旋震蕩15 s，放進冰槽里孵育60 min，其間每10 min強力渦旋震蕩15 s一次；即刻4℃離心16 000 g×5 min，小心移取上清液到新的Eppendorf管中，分裝后放進-70℃的冰箱里備用。

1.2.6 Western blot法檢測細胞核中NF-κB含量的變化 采用BCA蛋白分析法測定提取好的HUVEC細胞核蛋白濃度，在各組樣品中加入適量的SDS-PAGE緩沖液，80～100℃沸水浴5 min。將蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔，電泳電壓100 V，30 min，溴酚藍到達膠的底端附近停止電泳。采用Bio-Rad半干法轉(zhuǎn)PVDF膜，電壓25 V，60 min，轉(zhuǎn)膜完畢后，PBST洗膜3次，5 min/次，5%脫脂奶粉封閉1 h后，PBST洗膜3次，5 min/次。NF-κB兔抗人單克隆抗體(1∶1 000)，孵育過夜，PBST洗膜3次，5 min/次，HRP標記的羊抗兔IgG抗體(1∶10 000)，孵育1 h后，PBST洗膜3次，5 min/次，顯影。顯影后的PVDF膜用0.2 mol/L NaOH振蕩清洗后重新用Lamin B1兔抗人多克隆抗體檢測，方法同上。

1.2.7 Western blot法檢測細胞中A20、p-IKK、NF-κB和p-NF-κB的變化 收集HUVEC細胞并采用細胞裂解液裂解，BCA蛋白分析法測定細胞總蛋白濃度，一抗分別為A20抗體、p-IKK抗體、NF-κB抗體和p-NF-κB抗體(1∶1 000)，內(nèi)標為β-actin抗體，二抗為HRP標記的羊抗兔IgG抗體(1∶10 000)，操作步驟同上。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗驗證let-7f與A20的靶向關(guān)系 用Trizol提取細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增A20基因3’-UTR片段，上游引物5’-ATACTAGTCCGGAAACAGGTGGGTCACCTC-3’，下游引物5’-ATACGCGTGTTGACTCTTGTGAAAAGTTACATT-3’，將A20 3’-UTR克隆至pmiReport載體中構(gòu)建pmiReport-A20(WT)載體，利用點突變試劑盒突變pmiReport-A20(WT)上let-7f結(jié)合位點構(gòu)建突變pmiReport-A20(mut)載體。將HEK293細胞以1×105/ml的密度接種于24孔板上，采用Lipofectamine 2000將報告載體分別與let-7f mimics、miR-NC共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后，采用Dual Luciferase?Reporter Assay System試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 ox-LDL對HUVEC細胞ICAM-1表達的影響

采用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液中ICAM-1含量，如圖1所示，20 μg/ml ox-LDL作用24 h，可導致ICAM-1的含量較對照組顯著升高[(9.71±0.42)ng/ml比(4.65±0.29)ng/ml]，與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)，且隨著ox-LDL作用劑量增加到100 μg/ml后，ICAM-1的含量逐漸增多，與對照組相比差異更為顯著(P<0.01)，提示ox-LDL作用濃度與ICAM-1的表達具有明顯的劑量依賴性。

與對照組比，aP<0.05，bP<0.01(n=6)

2.2 ox-LDL對HUVEC細胞let-7f表達的影響

采用RT-qPCR方法檢測HUVEC細胞中l(wèi)et-7f的表達，如圖2所示，20 μg/ml ox-LDL作用24 h，可導致let-7f的相對表達量較對照組顯著上調(diào)(0.20±0.02 比 0.12±0.01)，與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，且隨著ox-LDL作用劑量增加到100 μg/ml后，let-7f的表達逐漸增多，與對照組相比差異更為顯著(P<0.01)，提示ox-LDL作用濃度與let-7f的表達具有明顯的劑量依賴性。

與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01(n=6)

2.3 ox-LDL對HUVEC細胞核NF-κB蛋白含量的影響

采用Western blot檢測HUVEC核內(nèi)NF-κB蛋白的含量，如圖3所示，10 μg/ml ox-LDL作用24 h，可導致HUVEC核內(nèi)NF-κB蛋白增多，以不同劑量的ox-LDL(20、50、100、200 μg/ml)作用于HUVEC后，發(fā)現(xiàn)細胞核內(nèi)NF-κB蛋白含量呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢，表明ox-LDL可導致HUVEC細胞的NF-κB向核內(nèi)移位。

圖3 不同劑量ox-LDL引起HUVEC核內(nèi)NF-κB-P65蛋白含量的變化情況(n=3)

2.4 ox-LDL對HUVEC細胞A20表達及NF-κB通路的影響

采用100 μg/ml ox-LDL作用于HUVEC 24 h，Western blot檢測細胞內(nèi)A20、IKK、NF-κB和p-NF-κB的表達情況，如圖4所示，ox-LDL可導致細胞內(nèi)A20表達顯著下調(diào)，同時IKK蛋白水平也明顯降低，對NF-κB的表達無顯著影響，但是NF-κB的磷酸化水平明顯升高，表明ox-LDL可通過抑制HUVEC細胞A20的表達，引起IKK被磷酸化，導致NF-κB被磷酸化。

圖4 ox-LDL作用于HUVEC細胞對A20及NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達影響(n=3)

2.5 let-7f與A20基因3’-UTR靶向結(jié)合并抑制其表達

通過TargetScan數(shù)據(jù)庫的搜索及預測，發(fā)現(xiàn)let-7f與A20具有靶向結(jié)合的序列，分組轉(zhuǎn)染后通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行檢測，發(fā)現(xiàn)在HEK293細胞中，pmiReport-A20(WT)載體與let-7f mimics共轉(zhuǎn)染的細胞組相對熒光素酶活性較pmiReport-A20(WT)載體與miR-NC共轉(zhuǎn)染的細胞組明顯降低(P<0.05)。而pmiReport-A20(mut)載體與let-7f mimics共轉(zhuǎn)染的細胞組相對熒光素酶活性較pmiReport-A20(mut)載體與miR-NC共轉(zhuǎn)染的細胞組，差異無統(tǒng)計學意義。表明let-7f直接與A20基因3’-UTR靶向結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用(圖5A)。采用let-7f mimics、miR-NC分別轉(zhuǎn)染HUVEC，Western blot檢測細胞內(nèi)A20的表達情況，結(jié)果顯示，let-7f mimics細胞組A20的表達與對照組、miR-NC組相比明顯降低，而miR-NC組與對照組相比無明顯變化，表明let-7f能夠通過靶向結(jié)合A20基因3’-UTR而抑制其表達(圖5B)。

A：熒光素酶報告基因檢測let-7f與A20基因3’-UTR的靶向結(jié)合；B：let-7f轉(zhuǎn)染HUVEC細胞抑制A20的表達(n=3)，與miR-NC組比較，aP<0.05(n=3)

3 討論

Let-7家族的各miRNA是最早發(fā)現(xiàn)的一類miRNA，以let-7為起點，眾多的miRNA相繼被發(fā)現(xiàn)，目前已有數(shù)千種功能各異的miRNAs被證實，在人體的多種生理機能及病理過程中發(fā)揮著重要的作用[15]。目前研究表明，let-7家族成員與AS的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系[16]。ox-LDL可誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡過程中l(wèi)et-7c表達上調(diào)，let-7c靶向調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達進而促進血管內(nèi)皮細胞凋亡發(fā)生[8]，提示let-7c是一種促AS因子。TLR4信號傳導途徑是調(diào)控致炎因子釋放并參與冠心病發(fā)病過程的重要途徑，有研究發(fā)現(xiàn)let-7i調(diào)控TLR4表達是冠心病發(fā)病的分子機制之一[17]。

對結(jié)核桿菌感染巨噬細胞的研究發(fā)現(xiàn)，let-7f能夠通過活化NF-κB信號通路，促進TNF、IL-1b等細胞因子表達，誘導免疫炎癥反應(yīng)[14]，提示let-7f可能通過調(diào)控炎癥因子表達而參與AS起始過程。但是目前對let-7f在AS形成過程中的表達變化尚不清楚，let-7f參與AS形成的分子機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，20 μg/ml ox-LDL作用于血管內(nèi)皮細胞可引起ICAM-1表達明顯升高；同時，let-7f的表達也明顯增多；隨著 ox-LDL作用劑量的增加，ICAM-1與 let-7f的表達均呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢，具有劑量效應(yīng)關(guān)系，研究結(jié)果表明let-7f在ox-LDL致血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

NF-κB是哺乳動物細胞中最重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一，其參與了炎癥、細胞增殖、分化和凋亡等的調(diào)節(jié)。靜息狀態(tài)下，無活性的NF-κB以異源三聚體(P50、P65、IκB-α)形式存在于胞質(zhì)中。但在許多因素誘導下，胞外刺激可通過多個信號傳導途徑激活蛋白激酶并使 IKK復合體被磷酸化，磷酸化的IKK復合體繼而磷酸化降解IκB-α，使NF-κB二聚體(P50，P65)發(fā)生核易位，從而引起細胞因子、趨化因子、粘附分子和促凋亡基因等靶基因的表達[18]，介導白細胞和血管內(nèi)皮細胞的相互作用以及血管細胞的損傷。本研究中通過Western blot法檢測血管內(nèi)皮細胞核內(nèi)NF-κB蛋白的表達水平，結(jié)果顯示20 μg/ml ox-LDL作用于血管內(nèi)皮細胞可引起NF-κB蛋白核內(nèi)移位明顯增多，隨著ox-LDL作用劑量的增加呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢，與ox-LDL所致ICAM-1和 let-7f的表達變化規(guī)律一致，表明let-7f可通過調(diào)控NF-κB信號傳導通路的活化介導ox-LDL引發(fā)的血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白A20能夠阻止IKK被磷酸化，抑制NF-κB的活化，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)作用[13]。我們的研究證實，let-7f能夠與A20基因的3’-UTR靶向結(jié)合并抑制其表達，ox-LDL作用于血管內(nèi)皮細胞能夠明顯抑制A20的表達，引起IKK被磷酸化，進一步使NF-κB磷酸化增多并向細胞核轉(zhuǎn)移，NF-κB信號通路激活，從而誘導血管內(nèi)皮細胞炎癥因子的表達分泌，研究結(jié)果初步闡明了let-7f參與AS形成起始過程的分子機制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導血管內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)過程中，let-7f表達規(guī)律與ICAM-1表達規(guī)律以及NF-κB向核內(nèi)移位存在一致性，let-7f可通過靶向抑制A20基因的表達，促使IKK被磷酸化，并進一步激活NF-κB信號通路。通過控制let-7f的表達上調(diào)而抑制血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)，可能為AS的防治提供新的靶點和方向。

利益沖突：無