甄愛(ài)華，陳敬德，李 霞，張 莉，戴偉平，李昌吉

（酒泉市人民醫(yī)院，甘肅 酒泉 735000）

Cornulin蛋白是S100蛋白中的一員，在N端有一鈣結(jié)合位點(diǎn)[1]。另一項(xiàng)研究表明，Cornulin基因是融合基因中的一員，可能在表皮分化中起著重要的作用[2]。雖然Cornulin基因在ESCC中表達(dá)下調(diào)，很可能在正常組織向腫瘤組織轉(zhuǎn)變中丟失[3]，但Cornulin蛋白表達(dá)情況及其與臨床病理特征和5年生存率之間的關(guān)系無(wú)相關(guān)研究。黑素瘤是一種高度惡性的腫瘤，多發(fā)生于皮膚，占皮膚惡性腫瘤的第三位（占6.8%～20%）[4]，其惡性程度高，極易發(fā)生潰瘍和轉(zhuǎn)移，死亡率占皮膚癌死亡人數(shù)的70%[5]。統(tǒng)計(jì)顯示，在全球范圍內(nèi)，黑素瘤的發(fā)病率正在逐年上升[6]，不僅給患者本人帶來(lái)極大的痛苦，也造成很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而極少數(shù)的痣細(xì)胞痣有惡變?yōu)楹谒亓龅目赡?。因此，研究Cornulin在黑素瘤發(fā)病中的機(jī)制，對(duì)探索新的靶向治療措施有重要意義。我們采用免疫組化方法分析了痣細(xì)胞痣、黑素瘤中Cornulin的表達(dá)，以探討其在這兩種疾病發(fā)生、發(fā)展中所起的作用。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2010年7月至2016年7月甘肅酒泉市人民醫(yī)院皮膚科病理室診斷為痣細(xì)胞痣患者的蠟塊38例和黑素瘤患者的蠟塊42例（無(wú)其他皮膚病或系統(tǒng)性疾?。?。痣細(xì)胞痣中，男15例，女23例，年齡14～61歲，平均41.3歲；黑素瘤中，男17例，女25例，年齡14～88歲，平均51.3歲。另選用美容科美容手術(shù)切除的正常皮膚組織32例作為對(duì)照組，其中男15例，女17例；年齡19～63歲，平均38.6歲?；颊咝詣e、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑

兔免疫組化試劑盒及DBA酶底物試劑盒（購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）、Cornulin兔抗人單克隆抗體（購(gòu)自CellSignaling Technology公司），抗體工作濃度為 1∶100。

1.3 方法

新鮮組織常規(guī)固定包埋，切片常規(guī)脫蠟、水化后用0.25%高錳酸鉀20 min、5%草酸1 min，以脫去黑色素；3%雙氧水孵育10 min，以去除組織內(nèi)固有的過(guò)氧化物酶；枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)：92℃水浴5 min，自然冷卻；山羊血清封閉液室溫孵育15 min，以去除非特異性染色。一抗4℃結(jié)合置于冰箱過(guò)夜，二抗37℃孵育15 min，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素37℃孵育15 min，DAB染色，蘇木素復(fù)染，陰性對(duì)照用枸櫞酸緩沖液代替一抗或二抗。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 觀察內(nèi)容 Cornulin陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕黃色或褐色顆粒。

1.4.2 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 在400倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察細(xì)胞染色的強(qiáng)度，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。

腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性率＜5%為0分，5%～25%為1，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；根據(jù)染色強(qiáng)度分為4級(jí)，無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度相乘為該視野得分，最終得分為10個(gè)視野得分的平均值。0分為陰性（-），1～4分為弱陽(yáng)性（+），5～8分為中度陽(yáng)性（++），9～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件，用χ2檢驗(yàn)對(duì)各組Cornulin表達(dá)的陽(yáng)性率進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cornulin 在正常皮膚組織、痣細(xì)胞痣及黑素瘤中的表達(dá)情況

免疫組化顯示，在32例正常皮膚組織，Cornulin弱表達(dá)于表皮基底層，陽(yáng)性率為56.25%（18/32），見(jiàn)圖1；在38例痣細(xì)胞痣患者的皮損中，Cornulin表達(dá)于靠近表皮的部分痣細(xì)胞和真皮內(nèi)的痣細(xì)胞，陽(yáng)性率為52.63%（20/38），見(jiàn)圖2；在42例黑素瘤患者的皮損中，Cornulin表達(dá)于幾乎所有的瘤細(xì)胞中，陽(yáng)性率為 92.86%（39/42），見(jiàn)圖 3。

2.2 Cornulin在痣細(xì)胞痣、黑素瘤及正常皮膚組織中的表達(dá)情況

在38例痣細(xì)胞痣患者皮損中的Cornulin與正常皮膚表皮相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.454，P＞0.05）；在 42 例黑素瘤患者皮損中的Cornulin表達(dá)與正常皮膚表皮相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.644，P＜0.001），與痣細(xì)胞痣相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.722，P＜0.001），見(jiàn)表 1。

圖1 Cornulin在正常皮膚組織中的表達(dá)（SP×200）

圖2 Cornulin在痣細(xì)胞痣中的表達(dá)（SP×200）

圖3 Cornulin在黑素瘤中的表達(dá)（SP×200）

表1 Cornulin在正常皮膚組織、痣細(xì)胞痣和黑素瘤中的表達(dá)

3 討論

3.1 Cornulin研究現(xiàn)狀

Cornulin也稱C1orf10和SEP53，最初是Xu等[7]于2000年在食管上皮細(xì)胞中應(yīng)用改良的分化顯示PCR方法發(fā)現(xiàn)的。由于Cornulin在熱休克后合成明顯增多，并且編碼了一個(gè)分子量53 kDa的鈣結(jié)合蛋白，故Yagui-Beltran等[8]于2001年又稱C1orf10為SEP53。C1orf10產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，并且它的結(jié)構(gòu)特征與表皮分化復(fù)合體的融合基因家族成員相似，在表皮分化中起作用，故Contzler稱之為Cornulin[2]。Cornulin是分子量為53kDa編碼495個(gè)氨基酸，且它的N末端有約90個(gè)殘基的鈣結(jié)合基序和60個(gè)氨基酸的保守連續(xù)重復(fù)序列，Cornulin是編碼在表皮分化復(fù)合體的1q21染色體上，主要定位在細(xì)胞質(zhì)和核周區(qū)[2-3]。除食管上皮細(xì)胞外[2-3，9]，口腔鱗狀上皮細(xì)胞[10-11]、宮頸鱗狀上皮細(xì)胞[12]、表皮鱗狀上皮細(xì)胞[13]、瞼板腺上皮細(xì)胞和甲狀腺濾泡等也被鑒定出了Cornulin。除在鱗狀細(xì)胞腫瘤如食管上皮細(xì)胞瘤[2]、口腔上皮細(xì)胞瘤[10-11]、宮頸鱗狀上皮細(xì)胞[12]、頭頸部上皮細(xì)胞瘤[14]，還有甲狀腺癌和濕疹等的Cornulin表達(dá)也降低。

3.2 Cornulin在黑素瘤中的表達(dá)高于正常組織

黑素瘤是來(lái)源于黑素細(xì)胞、惡性程度較高的惡性腫瘤，部分患者可由痣細(xì)胞痣演變而來(lái)[4]。我們的實(shí)驗(yàn)表明，Cornulin在皮膚黑素瘤中的表達(dá)顯著高于正常皮膚組織及痣細(xì)胞痣（P＜0.001），在痣細(xì)胞痣中的表達(dá)雖然高于正常皮膚組織，但二者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明其在上述皮膚病中起一定作用。隨著黑素細(xì)胞不典型分化程度的增加及病變范圍的擴(kuò)大，Cornulin表達(dá)呈上升趨勢(shì)，可能在腫瘤惡性程度的增加及疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮一定作用，然而具體機(jī)制尚不完全清楚。Cornulin能否作為判斷皮膚黑素瘤浸潤(rùn)程度及預(yù)后的指標(biāo)，尚需進(jìn)一步研究。