陳 艷 黃代文

樂(lè)山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 四川樂(lè)山 614000

四環(huán)素類抗生素藥物包括四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素，它是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜性抗生素，是我國(guó)應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)、應(yīng)用范圍最廣的動(dòng)物抗生素[1,2]，四環(huán)素類藥物廣泛的應(yīng)用于獸藥和飼料添加劑方面[3]，它可以較強(qiáng)的抑制多種病原菌，可用于大范圍的畜禽疾病的預(yù)防與治療[4]。由于食品中殘留的四環(huán)素類抗生素可破壞人體正常的腸道菌群平衡[5]，另外還具有溶血或肝毒作用，對(duì)胃腸、肝臟的損害較大[6]，更嚴(yán)重的是四環(huán)素類抗生素具有致突變性和潛在的致癌性[7,8]。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)將色譜法對(duì)復(fù)雜組分的高分離能力與質(zhì)譜法具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，使用質(zhì)譜作為檢測(cè)器，對(duì)化學(xué)組分進(jìn)行定量和定性分析，在食品、環(huán)境、醫(yī)學(xué)等許多分析分離的領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[9]。

LC-MS/MS檢測(cè)靈敏度高、前處理簡(jiǎn)單、定性定量準(zhǔn)確，近年來(lái)已成為食品藥品以及農(nóng)產(chǎn)品中痕量藥物殘留分析的關(guān)鍵技術(shù)[10～15]。而超高效液相色譜-串聯(lián)技術(shù)(UPLC-MS/MS)相比較傳統(tǒng)的LC-MS/MS，檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性均有顯著的提高，檢測(cè)時(shí)間縮短，適用于獸藥多殘留的快速檢測(cè)[16]。

本論文采集了樂(lè)山市及周邊地區(qū)市售的不同品種鹵肉制品，在GB/T 21317-2007《動(dòng)物源食品中四環(huán)素類獸藥殘留檢測(cè)方法》[17]的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品提取方式、提取液的選擇、流動(dòng)相的選擇、固相萃取柱和色譜柱的選擇進(jìn)行了研究及討論，建立一套靈敏度高、檢測(cè)準(zhǔn)確的分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)市售鹵肉制品中的四環(huán)素類藥物同時(shí)提取和檢測(cè)，并對(duì)樂(lè)山市及周邊地區(qū)市場(chǎng)上鹵肉制品中的四環(huán)素類抗生素進(jìn)行了檢測(cè)和質(zhì)量安全評(píng)價(jià)分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters超高效液相色譜一四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(I-Class&Xevo，TQD)，配有電噴霧離子源(ESI)和Masslynx 4.0工作站、Waters Oasis HLB固相萃取柱(200mg/6mL)，購(gòu)自美國(guó)Waters公司；

OA-SYS氮吹儀購(gòu)自O(shè)rganomation Associates,Jnc；

電子分析天平(TLE204/02)，購(gòu)自瑞典梅特勒托利多公司；

湘儀H1850醫(yī)用離心機(jī)，購(gòu)自長(zhǎng)沙高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于99.0%)，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstotfer；

甲醇、乙腈(色譜純)，購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；

檸檬酸、磷酸二氫鈉二水化合物、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、氫氧化鈉(分析純)，購(gòu)自成都科隆化學(xué)品有限公司。

試驗(yàn)用水為經(jīng)UP凈化系統(tǒng)0.22μm過(guò)濾膜過(guò)濾的純化水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1 EDTA-Mcllvaine緩沖液

稱取11.8g檸檬酸-水合物、13.72g磷酸氫二鈉二水合物、33.62g乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na))溶解于1L水中，用稀鹽酸及氫氧化鈉調(diào)pH值至4.1，用作四環(huán)素類抗生素提取液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

將四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-18℃避光保存。

1.2.3 工作液

將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋成0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.4 流動(dòng)相的配制

0.1%甲酸水，0.50mL甲酸(色譜純)加入500mL經(jīng)過(guò)0.22μm過(guò)濾膜過(guò)濾的純水中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取經(jīng)組織粉碎機(jī)粉碎的樣品5g(精確到0.001g)于50mL塑料離心管中，加入20mL EDTA-Mellvaine緩沖溶液，渦旋振蕩混合1min，超聲提取20min，6 000r/min離心5min，經(jīng)濾紙過(guò)濾后收集上清液于離心管中。殘?jiān)偌尤?0mL EDTA-Mellvaine緩沖溶液，重復(fù)提取一次，合并提取液。用6mL甲醇、6mL水活化HLB固相萃取柱，取10mL樣品提取液過(guò)固相萃取柱，控制流速為1滴/s左右，再用5mL水和5mL甲醇洗滌小柱，抽干，用10mL甲醇+乙酸乙酯(1+9)溶液洗脫，收集洗脫液，旋蒸發(fā)至干后，用1mL 0.1%甲酸-水溶液溶解殘?jiān)?jīng)0.22μm水相濾膜過(guò)濾后，進(jìn)行LC-MS/MS分析。采用陰性樣品基質(zhì)加標(biāo)外標(biāo)法定量計(jì)算。

1.3.2 空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

稱取與待測(cè)樣品基質(zhì)相同或相近的空白樣品，分別加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3.1處理，制成一定濃度的空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，繪制空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 色譜條件

1.4.1 液相色譜條件

Waters ACQUITY-UPLCTM BEH C18色譜柱(100mmx2.1mm,1.7μm)。

流動(dòng)相：乙腈(B)—0.1%甲酸水溶液(A)。

流速：0.4mL/min。

進(jìn)樣體積：5μL。

柱溫：40℃。

按照表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離(ESI)，正離子模式。

毛細(xì)管電壓：4.5kV。

萃取電壓：3V。

離子源溫度：150℃。

脫溶劑氣溫度：500℃。

脫溶劑氣流量：650L/h。

碰撞氣為氬氣，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方式的選擇

實(shí)驗(yàn)中對(duì)樣品常用的提取方式分別作出了比較。將樣品勻漿制備后加入標(biāo)準(zhǔn)品，分別采取靜置提取、振蕩提取和超聲波提取三種提取方式，提取相同時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用三種提取方式分別提取時(shí)，超聲波提取的回收率最高，振蕩提取第二，靜置提取的回收率最低；其原因在于靜置提取和振蕩提取時(shí)，由于溶劑介質(zhì)分子活性較低，對(duì)樣品的滲透不充分，因此降低了提取效果；而采用超聲波提取樣品時(shí)，由于超聲波具有機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，可以增強(qiáng)介質(zhì)穿透力、加快介質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度，使得目標(biāo)物的溶出加快，從而使提取效率提高[18,19]。因此，在實(shí)驗(yàn)中均選取超聲波提取作為目標(biāo)物的提取方式。

2.2 樣品提取液的選擇

樣品提取方式參考GB/T 21317-2007《動(dòng)物源食品中四環(huán)素類獸藥殘留檢測(cè)方法》，考察了分別使用純水、EDTA-Mcllvaine緩沖液、5%高氯酸溶液[20]、乙腈四種提取溶劑，提取溶液對(duì)四環(huán)素類藥物回收率的影響如圖1所示。由于四環(huán)素類藥物容易發(fā)生降解，并且可以結(jié)合蛋白質(zhì)形成不溶性絡(luò)合物，在堿性條件下則容易生成同分異構(gòu)體；而這類藥物在弱酸性溶液中則比較穩(wěn)定，所以在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該選擇含金屬絡(luò)合劑的弱酸性提取液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：EDTA-Mcllvaine緩沖液有利于藥物在HLB固相萃取小柱上保留，并且可以減少四環(huán)素類藥物與金屬離子的螯合反應(yīng)[21]，從而提高提取效率，提取效果最好。因此在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，均采用EDTA-Mcllvaine溶液進(jìn)行樣品的前處理提取[22]。

圖1 提取溶液對(duì)4種四環(huán)素類平均回收率的影響

2.3 固相萃取條件的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了常用的中性氧化鋁小柱、PEP固相萃取柱、Oasis HLB小柱以及C18小柱等固相萃取柱對(duì)四種四環(huán)素類藥物的凈化效果。Oasis HLB柱是一種新型的親水親脂平衡柱，廣泛應(yīng)用于食品中獸藥殘留的前處理，如動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類、氯霉素類、硝基呋喃類、喹諾酮類獸藥殘留的前處理。它具有良好的水可浸潤(rùn)性和化學(xué)穩(wěn)定性，表面同時(shí)具有親水性和疏水性官能團(tuán)，從而對(duì)各類極性、非極性化合物具有均衡的吸附作用。其吸附能力大，樣品容量高，對(duì)大部分有機(jī)物的吸附容量增大，回收率也更高，且在吸附后有機(jī)物容易被定量洗脫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：HLB柱利用非極性相互作用將四環(huán)類抗生素保留在柱上，能有效去除極性較大的雜質(zhì)，相對(duì)保留容量較傳統(tǒng)C18柱高，吸附性較強(qiáng)，對(duì)基質(zhì)的凈化效果較好，目標(biāo)物受雜質(zhì)的干擾較小，可保留更多的分析物，提高固相提取方法的回收率。所以實(shí)驗(yàn)選擇Oasis HLB小柱作為樣品提取溶液的凈化和富集柱。

本實(shí)驗(yàn)選用了甲醇-乙酸乙酯混合液作為洗脫劑[23]，試驗(yàn)比較了不同洗脫液體積比，分別采用V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)=5∶95、10∶90、20∶80、30∶70，對(duì)提取后的基質(zhì)加標(biāo)樣品進(jìn)行洗脫并測(cè)定，通過(guò)比較回收率，最終確定V(甲醇)∶V(乙酸乙酯)=10∶90作為洗脫液比例。

2.4 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了甲醇—水、甲醇—0.1%甲酸水、甲醇—乙腈—0.1%甲酸水[25]和乙腈—20mmol/L草酸[25]作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：流動(dòng)相中未加入0.1%甲酸的情況下，四環(huán)素類藥物的電離效果較差，峰型對(duì)稱性差，加入一定比例的0.1%甲酸后，增加離子化效率，改善了峰形利于分析。

2.5 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)考查了不同色譜柱在四環(huán)素藥物分離上的效果，包括Waters ACQUITY BEH C18柱(100mm×2.1mm，1.7μm)和Waters Atalantis T3(150mm×2.1mm，3μm)色譜柱[26～28]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：C18柱在本次實(shí)驗(yàn)研究中無(wú)論從分離效果和峰形均優(yōu)于T3柱，因此在實(shí)驗(yàn)中選擇使用C18柱作為色譜分離柱。

通過(guò)以上各種條件優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)最終采用EDTA-Mcllvaine緩沖液超聲提取，Oasis HLB小柱凈化，甲醇—乙酸乙酯混合液(10∶90)洗脫，乙腈—0.1%甲酸水作為流動(dòng)相梯度洗脫，選用Waters ACQUITY BEH C18色譜柱(100mm×2.1mm，1.7μm)，測(cè)得四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素總離子流圖，如圖2所示。

圖2 4種化合物總離子流圖(1.0μg/mL)PHam

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

四種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液線性關(guān)系見(jiàn)表3。

表3 四種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液線性關(guān)系

濃度分別為0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0μg/mL的空內(nèi)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以四環(huán)素、土霉素和金霉素峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好。

2.7 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

選擇鹵牛肉、鹵豬肉、鹵爪翅、鹵鴨四種樣品，在空白基質(zhì)中加入50、100、200μg/kg三個(gè)濃度添加水平，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素平均回收率分別為81.8%～103.7%、78.5%～99.4%、78.2%～101.6%、76.7%～97.1%，平均相對(duì)偏差分別為3.2%、1.9%、4.6%、3.3%(n=6)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 樣品測(cè)定及質(zhì)量安全分析

采用本實(shí)驗(yàn)方法，采集了樂(lè)山及周邊地區(qū)市售的220份鹵肉制品，對(duì)其進(jìn)行四環(huán)素類藥物殘留量的測(cè)定，以及對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量安全性分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：樂(lè)山及周邊地區(qū)鹵肉制品中四環(huán)素類藥物殘留均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，220份樣品中，四環(huán)素類檢出9份，其中四環(huán)素3份，強(qiáng)力霉素5份，土霉素1份，檢出值最大為33.8μg/kg，總檢出率4.1%；檢出值均符合中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)[29]、GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》[30]中規(guī)定的含量要求，無(wú)超標(biāo)產(chǎn)品。具體檢測(cè)分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 鹵肉制品中四環(huán)素類藥物殘留檢測(cè)情況

4 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)鹵肉制品中的四環(huán)素類藥物殘留的方法。通過(guò)優(yōu)化樣品、提取方式、提取條件和儀器條件，確立了鹵肉制品四環(huán)素、金霉素、土霉素抗生素殘留的UPLC-MS/MS分析方法。四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素在0.1～10μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r2>0.99)。在50、100、200μg/kg三個(gè)濃度添加水平，四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素平均回收率分別為81.8%～103.7%、78.5%～99.4%、78.2%～101.6%、76.7%～97.1%，平均相對(duì)偏差分別為3.2%、1.9%、4.6%、3.3%(n=6)；該方法準(zhǔn)確、快速、靈敏度高、重復(fù)性好、線性范圍寬、適用范圍廣，能夠準(zhǔn)確、快速、有效地進(jìn)行鹵肉制品中四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素的殘留檢測(cè)分析。另外，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)樂(lè)山及周邊地區(qū)鹵肉制品四環(huán)素類藥物殘留進(jìn)行了檢測(cè)，并進(jìn)行了食品質(zhì)量安全性分析，檢測(cè)結(jié)果均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。